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中华医学杂志】999年2月第79卷第2期NailMedJChina.
Fdamarv1999,79,№2'~L王重组乙型肝炎表面抗原插入突变体的真核表达及其抗原性的分析古柏燕任张定凤f2r、.
;7;、2,139.
基础研究【摘要】目的研究与乙型肝炎病毒感染的临床进程相差∞两种乙型肝炎表面抗原(HBsAg)插A变异体的莹痰学性以阐明在H瞻阴性的慢性乙型肝炎病毒感染中所起的作用.
方法利用体外PcR诱变方法.
构建重组}ms如的插人突变体;借助EB病毒载体pCEP4和逆转录病毒载体PXT1将重组插^变异S基因转染哺乳动物细胞;利用EHSA及Westernblot方法,探讨变异抗原与抗HBs的结台力.
结果(1)构建了HBsAg的插A突变体(分别在HBsAg的第122位与123位氨基酸问插人A蜡,Ala和第123位与124位氨基酸问插人Arg,Glv,Ala)的真核表达载体;(2)将其转染哺乳动物细胞,最终建立了能表达野生型和变异型HBsAg的~pc,2细胞系;(3)这些细胞系能在体外稳定地连续传代培养;(4)野生型H瞻可与抗HBs结合,变异型}ms如不能与抗}Ⅲs结合.
结论研究表明这两种插人变异体影响了HBs的空间结构.
从而使其失去与乙型肝炎病毒表面抗体的结合力,因而的于茎发秀静师袖孪寸【关键词】肝炎表面抗原,乙型突变.
插人基因表达n口彳.
彳,1竹'lh蛆ofreeamblnaat.
m鲫曲唱mIl0fI皿vitroadditsaatigelfiC帅Baiyan,RENHong,ZHANG如如r陆Hepaa~'/s,ChongqdfI血,Chongqing400010flll~elrtoelucidatethemleofinsertingmutantsinthedevelolmaentof}Ⅱk培negativechronichepatitisB.
Meth-odsTheinsemngmutantsof}Agc0rtI11cbyPER-mediatedmutm~nesismvitroEpstein-Ban"vinlsThe止吣ofpolyelonalandmonoclonalantibodiesagnitrst}Agformutantrestud~edbyELISAandwesternblot.
RI】】bTwoinsemonsWelveintr~lucedintosgene.
anda8ixnucleotideinsertionintr~lucedintroducedthreeaminoacids(Arg,Glyar,dAlaJbetncodons123and124.
Thesesgenessubelox~edintotwoeukaryoticexpressionvectors(pcEP4andPXT1).
andtherecombinanteukaryoficexpressionpl~midshadTheinsertionsmayresultinaeonfommfionaleofthe.
protein,andatt~,titsanfigenicities,8船ethattheinsertingmmmimasmaybecritics]forimmunoeseapeofHBVandinpartr仉sihkforcIlmni吣ofHlkag-negafi,,'eDabb.
(NatlMedJChina,1999,79:139—142)临床研究显示HBV的S区变异热点主要集中于"a"抗原决定簇编码区,发生于HIAg"a"抗原决定簇内的变异在一定范围内解释了免疫逃避株的出现及临床意义.
临床分析发现,30%~40%的HBsAg阴性的慢性乙型肝炎患者血清和肝组织中可本课题为国家自然科学基金重点项目及国家教委跨世纪优秀人才基金资助项目(3~30280)作者单位:400010重庆医科大学附属第=医院病毒性肝炎研究所用PcR方法检知HBVDNAl.
新近的研究在2例HBsAg阴性的中国慢性HBV感染者发现了发生于"a"抗原决定簇前的两株新的插人变异株,而同地区的30名HBsAg阳性患者中则未发现类似变异株存在.
为深入研究这两种咖s妇插入变异的生物学行为及其临床相关性,本研究利用体外PCR诱变方法,基因重组和真核表达等技术,构建了重组FIB—sAg的插入突变体;分别以耶病毒载体pCEP4和逆转录病毒载体PXT1为表达载体,在真核细胞上表http://www.
paper.
edu.
cn中国科技论文在线140中华医学杂志1999年2月第79卷第2期NallMedJChina,February1999,Vol79,No达了变异抗原,并对其抗原性作了初步分析.
材料与方法一、材料1.
质粒载体及菌株:pEeob6,pBluescriptKS见参考文献[5;pCEP4,为邙病毒真桉表达载体,转化菌TOPIOF(美国InvitroGene公司);PXT1,为逆转录病毒真桉表达载体,转化菌RRl(美国Strategen公司)2.
限制性核酸内切酶,_r棚酶,AMVRT-poly.
merase及其它修饰酶:均购自德国BoehringerMmmheim公司3.
质粒DNA提取,RNA提取及基因片段分离:采用德国Qiagen公司及上海华顺公司试剂盒二、方法1.
体外PCR诱变:根据HBV野毒株s区基因序列(已测)及相关文献l6J,分别设计两组体外插^诱变的引物,经Pcgene软件分析,由Cybers)~公司合成以pEcoD6为模板,分别利用s区的上游引物和方向与之相反的内侧诱变引物及s区的下游引物和方向与之相反的内侧诱变引物进行两套初级PCR,再将两套初级PCR产物混合,在一定的条件下变性,退火,然后再利用S区的上游引物进行PcR,由此获得的PCR产物中即含有太小约为680bp的已发生插入突变的s基因.
详细的步骤见参考文献l6js区的两条PCR引物:Pl(上游引物)5GTG&~GCT.
TA1粥AGAAcAT℃GcATCAG3;P2(下游引物)5GTI".
TAAATl(:TATACccAAAG3;插入变异株l(以后简称IM1)的内侧诱变引物:P35GTIGCCCGTFFG.
CATGGTCCGGTGCTG3;P45CAAACGGGCAACCT—G(I&CGACTCCTGC3;插入变异株2(以后简称IM2)的内侧诱变引物:P55AGCA~GCCCCGT—GIT兀BCA1BGT℃CGG0CIE3:P65&&CACGCGGCGCCTGC-&~GACTCC3W,C3.
2.
诱变产物的克隆及确证性测序:为了确定诱变基因的序列,首先应将其克隆到pBKS载体以制备单链DNA进行测序利用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段将所获得的野毒株及变异株s基因片段的3粘端去除,然后经HindIII酶切后纯化.
由此可获得一端为平端,另一端为粘端的野毒株及变异株s基因片段;将其克隆到pBluescriptKS载体的SmaI、Hind1II位点,转化受体菌XL1.
Blue.
制备质粒DNA,以XbaI作限制性内切酶分析,选择513性重组质粒按照常规方法制备单链DNA,用美国USB公司uereVersioi~,0试剂盒进行测序3.
野生型及变异型s基因真核表达载体的构建:采用两种真核表达载体表达野生型及变异型s基因,即将野生型及变异型s基因从pBKS一HBS系列重组体亚克隆到EB病毒真核表达载体pCEP4和逆转录病毒真核表达载体PXT!
将上述HBVS基因野生型和突变型的基因片段经BamHl和Kpn第1位点由DBlueseriptKS.
HBs定向克隆到真核表达载体pcEP4的相同位点,经限制性内切酶Sal1分析,筛选出阳性克隆.
用BarnHI和Ⅺ10I消化pBKS.
HBS系列重组体,分离纯化野生型和突变型s基因片段;PXT1经HindⅢ和BglⅡ消化,分离纯化小片段DNA;同时将PXT1经Hind1II和XholⅡ消化分离纯化太片段DNA;将两条载体片段与前面制备的目的基因连接后转化受体菌RR1.
制备质粒DNA,通过限制性内切酶HindⅢ分析,筛选出阳性克隆.
4,对HepG2细胞转染:采用电穿孔方法将口CEI~-重组体导^HepG2细胞,以潮霉素(Hv.
gromyeineB,美国CalBiochem公司)筛选抗性克隆.
5.
对PA317细胞转染:采用电穿孔方法将PXT1重组体导^PA317细胞,以G418(美国Promega公司)筛选抗性克隆.
6.
感染HepG2细胞:用含假病毒颗粒的PA3l7细胞培养上清感染HepG2细胞7.
HBsAg检测:采用厦门新科公司ELISA检测试剂盒8Westem—blot分析:抗HBs单抗及其他相关试剂购自深圳晶美公司.
结果一HBVS区的体外插入诱变(IM1和2)及确证性测序利用PCR诱变方法将两种插入突变引入s基因,初步PCR产物经电泳鉴定,发现获得了大小为320bp和360bp大小的两条DNA条带,将这两条含突变区的末端部分序列重叠的DNA利用s区外侧引物进行PCR扩增,获得的最终产物中含有太小约为680b口的基因片段pBKS载体含有1个XbaI位点,S基因也含有1个XbaI位点,因此重组质粒经XbaI消化后电泳呈现两条DNA带再经DNA序列分析鉴定(图1)表明两种插入突变已按预先设想引^s基因:IM1,在HBVDNA第519位棱苷酸前插^6个核苷酸,即在s基因第122位与123位密码子间插入Arg和Ala的密码子;IM2,在第519位核苷酸后