广西药用野生稻内生细菌多样性及促生作用

阳洁秦莹溪王晓甜尹坤江院袁涛谭志远(华南农业大学农学院,广州510642)摘要以广西药用野生稻为材料,采用两种选择性的无氮培养基进行内生细菌的分离,应用ISPCR指纹图谱方法对所分离到的内生细菌进行聚类分析.
选取每个类群的代表菌株进行16SrRNA基因序列测定及生理生化鉴定,通过菌株接种水稻对所分离的内生固氮菌进行促生作用的分析.
结果表明,从药用野生稻中分离纯化69株内生细菌,其中有26株内生固氮菌,其固氮酶活性在0.
60~46.
71μmolC2H4·mL-1·h-1.
通过ISPCR指纹图谱分析将所有供试菌株聚为11个类群及1个单菌株.
16SrRNA基因序列分析及生理生化鉴定表明,所分离的内生固氮菌属于艾德昂菌属(Ideonellaspp.
)、阿氏肠杆菌(Enterobacterasburiae)及固氮螺菌(Azospirillumlargimobile),植物内生细菌有短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、大田根瘤菌(Rhizobiumdaejeonense)、沙芬西芽孢杆菌(Bacillussafensis)、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)、过氧微杆菌(Microbacteriumparaoxydans)、类芽孢杆菌(Paenibacillusbarcinonensis)及粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)等,表明广西药用野生稻内生细菌具有多样性.
各内生细菌的代表菌株均具有溶磷解钾能力,其中yy34具有很强的溶磷能力,yy19、yy26及yy29具有较强的解钾能力.
此外,yy05、yy16、yy19、yy25、yy29、yy34及yy49共7株菌能分泌生长素.
将各内生固氮菌的代表菌株接种水稻后对水稻有着明显的促生作用,其中叶长增加了23.
0%~45.
2%,根长增加了19.
8%~36.
2%,分蘖数增加了59.
9%~119.
8%,全株鲜重增加了101.
4%~257.
0%,全株干重增加了68.
4%~101.
7%,根重增加了122.
2%~188.
9%.
关键词药用野生稻;内生细菌;多样性;促生作用国家自然科学基金项目(31370052)和广东省科技项目(2014a030313459,2014a050503058)资助.
通讯作者Email:zytan@scau.
edu.
com收稿日期:20150302接受日期:20150723中图分类号Q948.
12文献标识码A文章编号1000-4890(2015)11-3094-07DiversityandgrowthpromotionofendophyticbacteriaisolatedfromOryzaofficinalisinGuangxi.
YANGJie,QINYingxi,WANGXiaotian,YINKun,JIANGYuan,YUANTao,TANZhiyuan(CollegeofAgriculture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,510642,China).
ChineseJournalofEcology,2015,34(11):3094-3100.
Abstract:TheendophyticbacteriaisolatedfromOryzaofficinalisgrowinginGuangxiwerescreenedbytwonitrogenfreemediaandgroupedbyISPCRDNAfingerprinting.
Therepresentativestrainsofeachgroupwerefurtherstudiedbyphysiologicalandbiochemicaltests,and16SrRNAgeneanalysis.
Thepossibleplantgrowthpromotionoftheendophyticdiazotrophswastestedintherice.
Theresultsshowedthatatotalof69endophyticbacteriaincluding26endophyticdiazotrophswereobtainedfromO.
officinalis.
Thenitrogenaseactivityoftheendophyticdiazotrophsrangedfrom0.
60to46.
71μmolC2H4·mL-1·h-1.
The69endophyticbacteriawereassignedto11groupsand1ungroupedstrainbyanalysisofISPCRDNAfingerprinting.
16SrRNAgenesequencinganalysisofrepresentativestrainsofeachgroupshowedthattheendophyticdiazotrophswerecloselyrelatedtoIdeonellaspp.
,Enterobacterasburiae,Azospirillumlargimobile,andtheotherendophyticbacteriawerecloselyrelatedtoBacilluspumilus,B.
cereus,Rhizobiumdaejeonense,B.
safensis,Lysinibacillusfusiformis,Microbacteriumparaoxydans,Paenibacillusbarcinonensis,andSerratiamarcescens,whichindicatedthehighdiversityofendophyticbacteriacolonizedinthehostplantsofO.
officinalis.
Alloftherepresentativestrainsoftheendophytic生态学杂志ChineseJournalofEcology2015,34(11):3094-3100bacteriahavetheabilitytoreleasephosphateandpotassium.
Amongtheseendophyticbacteria,strainyy34hasagreatabilityofphosphatereleasingandstrainsyy19,yy26andyy29haveagreatabilityofpotassiumreleasing.
Sevenstrains(yy05,yy16,yy19,yy25,yy29,yy34andyy49)cansecreteindole3aceticacid.
Therepresentativestrainsoftheendophyticdiazotrophsinoculatedwithricesignificantlypromotedthericegrowth.
Theleaflengthofinoculatedriceincreasedby23.
0%-45.
2%,therootlengthincreasedby19.
8%-36.
2%,thetillernumberincreasedby59.
9%-119.
8%,thefreshweightofriceincreasedby101.
4%-257.
0%,thedryweightofriceincreasedby68.
4%-101.
7%,andtherootweightincreasedby122.
2%-188.
9%comparedwithnoninoculatedrice.
Keywords:Oryzaofficinalis;endophyticbacteria;diversity;growthpromoting.
药用野生稻由于长期处于野生状态,经受了各种灾害和环境的自然选择,从而使它具有抗病虫害、抗旱、耐贫瘠土壤等特性.
目前对药用野生稻的研究主要集中在遗传育种方面,但对其组织内微生物的研究尤其是内生固氮菌的研究却少见相关报道.
内生细菌是植物组织中的天然宿居者,它们部分或整个生活周期寄居在植物组织特别是营养繁殖的组织中生存、繁殖、传播而不会对植物引起明显的损害(Dbereiner,1992).
内生细菌寄居于宿主植物的组织中不仅不会引起宿主植物的损害,而且有些菌株还具有固氮、溶磷解钾、分泌植物生长激素、产铁载体及抗病原真菌等特性(张亮等,2013;王秀呈等,2014;Kuklaetal.
,2014;Ghoshetal.
,2015;Majeedetal.
,2015).
这些特性是内生细菌与宿主植物在长期共同进化中形成的一种互利共生关系,从而增强了宿主的抗逆性.
有研究表明,在普通野生稻(谭志远等,2009)、水稻(Jietal.
,2014)、小麦(刘小龙等,2012)、玉米(SzilagyiZecchinetal.
,2014)及狼尾草(Videiraetal.
,2013)等植物的组织中存在着丰富的内生固氮菌资源.
本文以广西药用野生稻为研究材料进行内生细菌的分离,通过ISPCR指纹图谱、16SrRNA基因序列测定等方法对所分离到的内生细菌进行聚类及多样性分析.
对分离到的内生固氮菌进行固氮酶nifH基因的扩增证明其固氮酶存在情况,通过生长素分泌定性试验、溶磷能力定性试验、解钾能力定性试验及菌株接种水稻对各内生固氮菌的代表菌株进行促生作用分析,为进一步的研究和应用提供参考.
1材料与方法11材料和培养基药用野生稻于2012年10月采自广西省梧州市长洲区倒水镇东阁3组的一处山洼.
CCM培养基(1L):Mannitol5g,Sucrose5g,CaCl2·2H2O0.
06g(分开灭菌),NaCl0.
1g,Lacticacide0.
5mL,NaMoO4·2H2O2.
5mg,MgSO4·7H2O0.
2g(分开灭菌),YeastExtract0.
1g,KH2PO4·H2O0.
2g,K2HPO4·H2O0.
8g,Fe(3)EDTA(0.
66%)4.
0mL,Agar15~20g,pH6.
8~7.
0.
NFb培养基(1L):苹果酸5g,K2HPO40.
5g,MgSO40.
2g,NaCl0.
1g,CaCl20.
02g,0.
5%溴百里香酚蓝2mL,微量元素溶液2mL,1.
64%Fe(3)EDTA2mL,KOH4.
5g,生物素0.
1g,盐酸吡哆0.
1g,Agar15~20g,pH6.
8~7.
0.
微量元素混合溶液(1L):硫酸铜0.
4g,硫酸锌0.
12g,硼酸1.
4g,钼酸钠1.
0g,硫酸锰1.
5g.
LB培养基:酵母粉5.
0g,蛋白胨10.
0g,NaCl5.
0g,Agar15~20g,蒸馏水1000mL,pH7.
0~7.
2.
12菌株分离纯化与固氮酶活性测定试验材料用蒸馏水洗净,剪下长度3~5cm根、茎、叶分别置于已灭菌的3个培养皿中,用70%乙醇浸泡5min,再用0.
1%的HgCl2浸泡3min,无菌水洗涤7次,每次8min,并将最后一次洗涤液涂布于LB固体培养基,以检测消毒是否彻底.
将表面消毒完全的根、茎、叶用灭菌剪刀剪碎,分别用灭菌镊子夹入到3支装有CCM及3支装有NFb半固体培养基的试管中,胶塞密封后,于37℃的细菌培养箱内进行培养.
待试管中长出菌体后,将菌株从试管中接种至相应的固体培养基上,平板划线分离,37℃继续培养.
挑取不同形态的单菌落分别接种至相应的半固体培养基中,继续平板划线直到获得纯的菌株,最后通过镜检,石炭酸复红染色,进一步观察其形态确定是否纯化.
纯化后的菌株于15%的甘油中-20℃保存.
纯化后的菌株接种于相应的装有5mL半固体培养基的10mL试管中,培养24h后,向管内注入乙炔气体(终浓度为1%),12h后,测定固氮酶活5903阳洁等:广西药用野生稻内生细菌多样性及促生作用性.
测定仪器为SP2100气相色谱仪,按公式N=hx*C*V/24.
9*hs*t,其中hx为样品峰面积;hs为标准C2H4峰面积;C为标准C2H4浓度(μmol·mL-1);V为培养容器体积(mL);t为C2H2反应时间(h);N为C2H4的浓度(μmol·mL-1·h-1)计算各菌株固氮酶活性(谭志远等,2009).
13ISPCR指纹图谱扩增及分析菌株DNA的提取见参考文献(谭志远等,2013),采用InsertionSequencebasedPCR(ISPCR)DNA指纹图谱的方法,以单引物J3(5′GCTCAGGTCAGGTGGCCTGG3′)作为ISPCR引物(原红娟等,2014).
PCR反应条件见文献(彭桂香等,2005).
PCR产物用1.
2%琼脂糖电泳初步聚类,将条带一致的归为同一类群,再用高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步聚类.
通过软件GIS3.
74凝胶图像处理系统进行分析,获得电泳图谱的相似性矩阵,用TREECON软件进行UPGMA聚类.
14固氮酶nifH基因的扩增利用Zehr等(1989)设计的引物:正向引物Zehrf(5′TGYGAYCCNAARGCNGA3′)和反向引物Zehrr(5′NDGCCATCATYTCNCC3′)(其中D:A,G或T;N:A,C,G或T;Y:C或T;R:A或G).
扩增nifH基因片段.
PCR反应条件:97℃预变性3min,97℃变性1min,55℃复性50s,72℃延伸35s,32个循环,反应完成后,72℃延伸5min.
1516SrRNA基因扩增PCR扩增引物(彭桂香等,2004)分别为:上游引物25f(5′AACTKAAGAGTTTGATCCTGGCTC3′)和下游引物1492r(5′TACGGCTACCTTGTTACGACT3′).
PCR反应条件见参考文献(Tanetal.
,2001).
扩增产物交中美泰和生物技术有限公司测序.
将所得序列在GenBank数据库中进行BLAST,获得相关菌种的名称.
16菌株生理生化鉴定甲基红试验、乙酰甲基甲醇试验、过氧化氢酶产生、脲酶试验、产氨试验、吲哚试验、明胶液化、淀粉水解试验、生长素分泌定性试验、溶磷能力定性试验、解钾能力定性试验参照《微生物学实验》(赵斌等,2002)进行.
17内生固氮菌接种水稻试验采用盆栽法把各内生固氮菌的代表菌株回接水表1广西药用野生稻中内生菌特性Table1CharacteristicsofendophyticbacteriaisolatedfromOryzaofficinalis菌株类群来源培养基酶活性菌株类群来源培养基酶活性菌株类群来源培养基酶活性yy02I根CCM-yy28I叶CCM-yy51IV根NFb-yy04I根CCM-yy29/叶CCM-yy52IV根NFb-yy05II根CCM1.
80yy30VIII根NFb46.
71yy53VII茎NFb-yy06II根CCM0.
60yy31VIII根NFb46.
17yy54VII茎NFb-yy07III根CCM-yy32VIII根NFb46.
14yy55VII茎NFb-yy09III根CCM-yy33VIII根NFb46.
16yy56VII茎NFb-yy10III根CCM-yy34VIII根NFb45.
46yy57VII茎NFb-yy12I根CCM-yy35IX根NFb-yy58I茎NFb-yy13III根CCM-yy36IX根NFb-yy59VIII茎NFb46.
09yy14II根CCM1.
05yy37IX根NFb-yy60VIII茎NFb45.
45yy15IV根CCM-yy38IX根NFb-yy61VIII茎NFb45.
40yy16IV根CCM-yy39X根NFb-yy62VIII茎NFb45.
15yy17IV根CCM-yy40X根NFb-yy63IX茎NFb-yy18V茎CCM0.
85yy41VI根NFb19.
69yy64IX茎NFb-yy19V茎CCM1.
88yy42VI根NFb19.
79yy65IX茎NFb-yy20V茎CCM2.
08yy43VI根NFb19.
69yy66IX茎NFb-yy21II茎CCM1.
35yy44VI根NFb19.
66yy67X叶NFb-yy22II茎CCM1.
46yy45VI根NFb23.
12yy68X叶NFb-yy23VI茎CCM19.
46yy46XI根NFb-yy69X叶NFb-yy24V茎CCM1.
58yy47XI根NFb-yy70X叶NFb-yy25VI茎CCM19.
48yy48XI根NFb-yy71X叶NFb-yy26VII叶CCM-yy49XI根NFb-yy72XI叶NFb-yy27VI叶CCM19.
47yy50XI根NFb-yy73XI叶NFb-表示无固氮酶活性,/表示未归类群,固氮酶活性的单位为μmolC2H4·mL-1·h-1.
6903生态学杂志第34卷第11期稻中嘉早17号,将菌株活化好,以保证在对数生长期内,制成菌悬液108cells·mL-1浓度浸泡有12d苗龄的水稻苗根部36h,对照用无菌水浸泡.
然后转接到装有540g水稻土的塑料大杯中,每个塑料大杯中再加入50mL植物无氮营养液,3个重复,放室温下进行培养.
每天及时观察、添加水.
培养观察至20d后,试验组加入相应的浓度为108cells·mL-1的菌液30mL及植物无氮营养液50mL,对照组加入等量无菌水及50mL植物无氮营养液.
继续培养观察至15d后拍照记录,并测定水稻的叶长、根长、分蘖数、鲜重、干重和根重.
2结果与分析21内生菌的分离结果及固氮酶活性利用2种无氮培养基,采用平板划线法,从广西药用野生稻中共分离纯化到69株内生菌,其中从根中分离到36株,占52.
2%;从茎中分离到22株,占31.
9%;从叶中分离到11株,占15.
9%(表1).
69株内生菌中有26株内生固氮菌,各内生固氮菌的固氮酶活性有较大的差异,固氮酶活性分布在0.
60~46.
71μmolC2H4·mL-1·h-1.
其中yy23、yy25、yy27、yy30、yy31、yy32、yy33、yy34、yy41、yy42、yy43、yy44、yy45、yy59、yy60、yy61、yy62共17株菌的固氮酶活性较高(酶活性均高于19.
46μmolC2H4·mL-1·h-1).
22ISPCR指纹聚类通过ISPCR指纹图谱分析,可以区分不同菌种的细菌.
采用高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳对ISPCR多态性指纹图谱检测,谱型聚类结果见图1.
由图1可知,在85%的水平上将69株内生菌分为11个主要类群以及一个单菌株yy29:其中类群Ⅰ有5个菌株,类群Ⅱ有5个菌株,类群Ⅲ有4个菌株,类群Ⅳ有5个菌株,类群Ⅴ有4个菌株,类群Ⅵ有8个菌株,类群Ⅶ有6个菌株,类群Ⅷ有9个菌株,类群Ⅸ有8个菌株,类群Ⅹ有7个菌株,类群Ⅺ有7个菌株.
23固氮酶nifH基因扩增利用乙炔还原法筛选到26株内生固氮菌后进行nifH基因的扩增,证明其固氮酶存在的情况.
结果表明所有的内生固氮菌均能扩增出约360bp的固氮酶nifH基因片段.
2416SrRNA基因序列相似性对各类群的代表菌株进行16SrRNA基因序列图1从药用野生稻中分离的69株内生细菌ISPCR指纹图谱相似性聚类图(UPGMA)Fig.
1DendrogramobtainedbyUPGMAmethodshowingthesimilaritylevelofISPCRpatternsof69endophyticbacteriaisolatedfromOryzaofficinalis测定,将测得的序列与GenBank数据库中的模式菌株序列比较,获得与各类群代表菌株相似性最高的已知菌种,结果见表2.
类群Ⅰ代表菌株yy04、类群Ⅲ代表菌株yy07、类群Ⅶ代表菌株yy26均属于芽孢杆菌,且都与各自的模式菌株的相似性为99.
9%;类群Ⅱ代表菌株yy05与类群Ⅵ菌株代表yy25为艾德昂菌属的不同菌种;类群Ⅳ代表菌株yy16与Rhizobiumdaejeonense相似性为99.
7%,为大田根瘤菌;类群Ⅴ代表菌株yy19与阿氏肠杆菌(Enterobacterasburiae)有98.
9%的相似性;类群Ⅷ代表菌株yy347903阳洁等:广西药用野生稻内生细菌多样性及促生作用表2各类群代表菌株的16SrRNA基因序列分析相似性结果Table2Similarityof16SrRNAgenesequencesoftherepresentativestrainscomparedwithknownspecies类群代表菌株相似性最高的已知菌种相似性(%)Ⅰyy04BacilluspumilusDSM27T(AY876289)99.
9Ⅱyy05IdeonellaazotifigensDSM21438T(EU542576)98.
4Ⅲyy07BacilluscereusDSM31T(AE016877)99.
9Ⅳyy16RhizobiumdaejeonenseJCM21505T(AY341343)99.
7Ⅴyy19EnterobacterasburiaeJCM6051T(AB004744)98.
9Ⅵyy25IdeonelladechloratansCCUG30977T(X72724)99.
8Ⅶyy26BacillussafensisNBRC100820T(AF234854)99.
9Ⅷyy34AzospirillumlargimobileACM2041T(X90759)99.
3Ⅸyy36LysinibacillusfusiformisDSM2898T(AF169537)98.
3Ⅹyy39MicrobacteriumparaoxydansDSM15019T(AJ491806)99.
9Ⅺyy49PaenibacillusbarcinonensisCECT7022T(AJ716019)98.
7未归类yy29SerratiamarcescensJCM1293T(AJ233431)99.
6与Azospirillumlargimobile有99.
3%的相似性,属于固氮螺菌;类群Ⅳ代表菌株yy36与纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)的相似性为98.
3%;类群Ⅹ代表菌株yy39与过氧微杆菌(Microbacteriumparaoxydans)相似性为99.
9%;类群Ⅺ代表菌株yy49属于类芽孢杆菌,与Paenibacillusbarcinonensis的相似性为98.
7%;未归类群yy29为粘质沙雷菌(Serratiamarcescens).
25各类群代表菌株生理生化试验鉴定由表3可见,yy04、yy05、yy16、yy19、yy25、yy26、yy34、yy36及yy39能分泌脲酶,将尿素分解为氨与碳酸;yy04、yy26、yy34及yy49在M·R试验中呈阳性反应;yy07、yy19、yy26及yy29在V·P试验中呈阳性反应;yy04、yy05、yy07、yy19、yy29、yy36及yy39具有过氧化氢酶,能将代射过程中产生的有毒性的过氧化氢水解为水和氧气;yy04、yy07、yy19、yy26、yy34、yy36及yy49具有产氨能力,表明这些内生菌能产生一种脱酰胺酶,可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨;yy04、yy07、yy16、yy19、yy26、yy34、yy36及yy49能分解色氨酸产生吲哚;yy07与yy29能产生明胶酶,将明胶水解为氨基酸,失去凝胶性质而液化;yy04、yy05、yy26、yy34、yy36及yy49具有淀粉水解酶,能把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖;yy05、yy16、yy19、yy25、yy29、yy34及yy49能分泌生长素,这些生物活性物质可以促进植物的生长;各类群代表菌株均具有溶磷解钾能力,其中yy19与yy34具有较强的溶磷能力,yy19、yy26及yy29具有较强的解钾能力,说明这些菌株可分泌酸性物质,并向周围的培养基扩散,从而形成透明圈.
26菌株对水稻的促生作用各内生固氮菌的代表菌株接种水稻经盆栽培养35d后,拍照并测量水稻的叶长、根长、分蘖数、根重、及全株的干重与鲜重.
由表4可以看出,各内生固氮菌的代表菌株接种水稻之后,与没有接菌的对照相比水稻的叶长、根长、分蘖数、根重及全株鲜重与干重都达到了显著差异,对水稻有明显的促生作用.
其中叶长增加了23.
0%~45.
2%,根增长了198%~36.
2%,分蘖数增加了59.
9%~119.
8%,全株鲜重增加了101.
4%~257.
0%,全株干重增加了68.
4%~101.
7%,根重增加了122.
2%~188.
9%.
表3各类群代表菌株生理生化试验结果Table3Physiologicalandbiochemicalpropertiesofrepresentativestrainsofeachgroupyy04yy05yy07yy16yy19yy25yy26yy29yy34yy36yy39yy49M·R试验V·P试验过氧化氢酶脲酶试验产氨试验吲哚试验明胶液化淀粉水解IAA分泌定性试验溶磷定性试验(L/D)1.
291.
121.
161.
261.
711.
441.
161.
082.
161.
201.
091.
18解钾定性试验(L/D)1.
051.
121.
201.
202.
031.
382.
102.
641.
141.
151.
071.
43L:溶磷圈或解钾圈直径,D:菌落直径,L/D:溶磷圈或解钾圈直径与菌落直径的比值.
8903生态学杂志第34卷第11期表4各内生固氮菌的代表菌株接种水稻后的促生效果Table4Promotiongrowthofthericeinoculatedwiththerepresentativestrainsofendophyticdiazotrophs接种菌株叶长(cm)根长(cm)分蘖数(株)鲜重(g)干重(g)根重(g)ck36.
17±1.
19d9.
56±0.
78c1.
67±0.
33c1.
42±0.
09d0.
57±0.
02b0.
09±0.
01byy0548.
92±0.
87b12.
83±0.
34ab3.
67±0.
33a4.
65±0.
47ab1.
15±0.
08a0.
26±0.
03ayy1952.
52±0.
62a13.
02±0.
76a3.
67±0.
33a5.
07±0.
53a1.
15±0.
07a0.
24±0.
03ayy2548.
49±0.
59b11.
45±0.
83b3.
00±0.
00b3.
38±0.
27c1.
07±0.
09a0.
20±0.
04ayy3444.
48±0.
69c12.
93±0.
45ab2.
67±0.
33b2.
86±0.
29c0.
96±0.
08a0.
20±0.
02a同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.
05).
3讨论内生固氮菌寄居于植物组织中,不仅能为宿主植物提供氮素营养,还能通过调节代谢,增强宿主对逆境的适应能力,是一类潜力巨大、尚待开发的微生物资源(Jhaetal.
,2009).
本研究从广西药用野生稻中分离到69株内生菌,其中有26株内生固氮菌.
应用ISPCR指纹图谱分析将所有供试菌株聚为11个类群及1个单菌株.
通过16SrRNA基因序列分析及生理生化鉴定表明所分离的内生固氮菌属于艾德昂菌属(Ideonellaspp.
)、阿氏肠杆菌(Enterobacterasburiae)、固氮螺菌(Azospirillumlargimobile),植物内生的细菌有短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、大田根瘤菌(Rhizobiumdaejeonense)、沙芬西芽孢杆菌(Bacillussafensis)、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)、过氧微杆菌(Microbacteriumparaoxydans)、类芽孢杆菌(Paenibacillusbarcinonensis)、粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)等不同菌种,表明药用野生稻中存在着丰富的内生菌资源.
谭志远等(2009)从普通野生水稻中分离的内生固氮菌分别有肠杆菌、艾德昂菌、克雷伯氏菌等.
孙建光等(2012)从小麦、水稻、玉米等作物中分离的内生固氮菌包含了根瘤菌、伯克霍尔德菌、肠杆菌、芽孢杆菌、类芽孢杆菌、克雷伯氏菌等菌种.
这表明不同植物中内生固氮菌的种群组成及丰度差异较大,这可能与分离材料及分离方法等多种因素相关.
所有内生固氮菌的固氮酶酶活性在0.
60~46.
71μmolC2H4·mL-1·h-1,表明不同内生固氮菌之间其固氮酶活性差异较大.
谭志远等(2009)从普通野生稻中分离筛选出37株内生固氮菌,其固氮酶活性在0.
85~42.
52μmolC2H4·mL-1·h-1.
齐安国(2008)研究表明,培养基、碳源、pH、温度等因素对不同固氮菌的固氮酶活性影响均不相同.
侯伟等(2009)研究表明,氮含量、温度、酸碱度、NaCl浓度等因素对固氮菌的固氮酶活性有一定的影响.
韩梅等(2010)研究表明,混合菌剂的固氮酶活性要明显高于单一菌剂的固氮酶活性.
26株内生固氮菌均能扩增出约360bp的nifH基因片段,从分子水平上证明其是固氮菌.
有研究表明,在固氮生物中编码固氮酶的nifH核苷酸序列具有高度保守性,因此是否含有nifH基因片段常被用来证明其是否为固氮菌的标准(TerakadoTonookaetal.
,2008).
从26株内生固氮菌中选取每个类群的代表菌株进行促生试验,结果表明,各类群代表菌均具有溶磷解钾能力,能分泌生长素、接种水稻后对水稻有着明显的促生作用.
有关固氮菌对作物的促生作用,国内外早已有相关文献报道.
王秀呈等(2014)分离到内生固氮菌DX35具有高固氮酶活性、产铁载体及溶磷等特性.
Narendra等(2015)从番茄根系中分离筛选到的5株具有溶磷及产生长素等特性的细菌,将这些菌株接种于番茄中能明显促进番茄的萌发、生长及产量的增加.
Anand等(2013)将固氮类芽孢杆菌P2b2R接种于凤梨中,能显著地减少凤梨萌发的死亡率以及促进叶片中氮含量的增加.
有研究表明,将固氮菌接种于水稻中,能明显促进水稻的生长.
DaSilvaAraujo等(2013)分离到的固氮菌具有固氮及分泌生长素等特性,接种水稻后能明显增加水稻的生物量及产量.
Estrada等(2013)从水稻中筛选到的固氮菌具有固氮及溶磷等特性,接种水稻后能显著增加水稻的产量.
Ji等(2014)从水稻中筛选到了12株内生固氮菌,这些菌株具有固氮、分泌生长素及产铁载体等特性,将这些菌株接种于水稻后,能明显增加水稻的株高、干重及抗病原真菌等特性.
接种固氮菌能够促进水稻生长,具有一定的应用价值,能否进行推广应用,需要进一步的试验.
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作者简介阳洁,男,1986年生,硕士研究生,研究方向为微生物的分离与鉴定.
Email:814736451@qq.
com责任编辑魏中青0013生态学杂志第34卷第11期