细胞信号网络能灵敏地反映小鼠胚胎干细胞的早期分化

细胞信号网络能灵敏地反映小鼠胚胎干细胞的早期分化乐志操,ZHUANGFengFeng4,LIUYi-Hsin4andHOChih-ming4Citation:中国科学:生命科学40,38(2010);doi:10.
1360/zc2010-40-1-38Viewonline:https://engine.
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com/doi/10.
1360/zc2010-40-1-38ViewTableofContents:https://engine.
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com/publisher/scp/journal/SSV/40/1Publishedbythe《中国科学》杂志社ArticlesyoumaybeinterestedinLincRNA1230抑制小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞分化SCIENTIASINICAVitae46,723(2016);成熟软骨细胞促进小鼠胚胎干细胞向软骨分化ScienceinChinaSeriesC-LifeSciences(inChinese)38,783(2008);维持Oct-4基因表达对小鼠胚胎干细胞分化的影响ChineseScienceBulletin46,730(2001);胚胎干细胞的诱导分化研究ScienceinChinaSeriesC-LifeSciences(inChinese)35,384(2005);一种高效的人胚胎干细胞早期造血分化和功能筛选模型的建立SCIENTIASINICAVitae43,762(2013);中国科学:生命科学2010年第40卷第1期:38~47SCIENTIASINICAVitaewww.
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comlife.
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com英文版见:YueZC,ZhuangFF,LiuYH,etal.
Interrogatingcellsignallingnetworksensitivelymonitorscellfatetransitionduringearlydifferentiationofmouseembryonicstemcells.
SciChinaLifeSci,2010,53,doi:10.
1007/s11427-010-0010-y《中国科学》杂志社SCIENCECHINAPRESS论文细胞信号网络能灵敏地反映小鼠胚胎干细胞的早期分化乐志操①②③,ZHUANGFengFeng④,LIUYi-Hsin④,HOChih-ming①②①DepartmentofMechanicalandAerospaceEngineering,UniversityofCalifornia,LosAngeles,CA90095,US;②CenterforCellControl,UniversityofCalifornia,LosAngeles,CA90095,US;③福州大学生命科学研究所,福州350108;④DepartmentofOphthalmologyandDohenyEyeInstitute,UniversityofSouthernCalifornia,LosAngeles,CA90033,USE-mail:raw600@gmail.
com收稿日期:2009-09-29;接受日期:2009-10-28NIHRoadmapforNanomedicine(批准号:PN2EY018228,C.
M.
H)及R01EY015417(Y.
L.
)资助项目摘要通常认为,动物个体中不同的细胞类型由转录因子的不同组合确定,并且常常通过一些特异表达的分子标记而被确认.
这些概念在干细胞研究中常常面临挑战.
在这里,我们通过一个小鼠胚胎干细胞体外分化的模型表明,在干细胞的分化过程中,干细胞的分子标记,如Oct4,Sox2,Nanog等不能反映细胞的早期分化.
另一方面,由蛋白质磷酸化所表征的细胞信号传导网络对外加因子刺激所产生的反应有显著变化.
本研究还表明,细胞信号传导网络的不可逆改变要先于转录因子表达水平的变化.
这也与信号传导调节细胞分化的概念是相符合的.
因此提议,通过检测细胞信号传导网络的变化,能够更精确地反映细胞的状态,以及揭示细胞分化早期的关键调控步骤.
希望提醒注意到用少数分子标记来表征细胞状态所面临的问题,而且提出了一种新的方法来解决这个问题.
关键词信号网络细胞确认分化小鼠胚胎干细胞细胞治疗在临床上被寄予极大希望.
为得到大量所需的细胞类型,从胚胎干细胞分化就成为最可能的选择之一[1,2].
这里很重要的一个问题就是质量控制,因为不同的实验室的培养条件及对细胞的处理方法有差别.
不同实验组的起始及终端细胞间有多相似这个细胞确认问题在体外分化实验中尤其重要,因为这时细胞以不均一的混合形式,经历一系列的发育过程,并多次改变其分化状态.
尽管一些分子标记的表达可以用来表征分化状态,但是绝大部分的分子标记在发育过程中其特异性都是相对的.
细胞分化命运的确定,是发育生物学中的一个关键问题,其中包括复杂的组织相互作用和多个信号传导途径的整合[3].
细胞通常都有一个分化系的历史,然后逐渐成为进一步分化的细胞类型.
在另一方面,细胞的分化状态又常常被认为是由转录因子的特异组合而确定.
这一观念被最近iPSC的成功诱导而得到强化:通过转入少数几个因子,成体动物的成纤维细胞和其他终端分化细胞都可以被重编程为类似于胚胎干细胞的iPSC[4~6].
然而,这个观点可能过于简化了,因为其中关于细胞分化的历史以及相关的信号传导事件都被忽略了.
揭示细胞内各元件组织方式的一个方法是,通https://engine.
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1360/zc2010-40-1-38中国科学:生命科学2010年第40卷第1期39过外加刺激来探讨细胞的反应方式.
细胞信号传导网络对刺激因子的特征性反应已经被应用于探讨肿瘤细胞状态的不均一性[7,8].
进一步研究表明,细胞对外加刺激的处理方式是通用的,而表现型的差别主要在于上游信号网络的激活方式有不同[9,10].
因此,细胞的特征有可能通过分析其信号传导网络来揭示.
这里用一个小鼠胚胎干细胞体外分化的模型来探讨细胞确认的问题.
1材料与方法1.
1小鼠胚胎干细胞的培养和扩增本研究中用到的细胞系包括Oct4-GFP,LW(由UCLA转基因和干细胞中心从129V系小鼠得到)以及AB2.
2.
小鼠胚胎干细胞的培养条件如下:培养皿用gelatin(0.
1%)包被,加小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为滋养层,1000U/mLLIF(Chemicon,CA),15%胎牛血清(HyClone,预先通过检测),0.
1mmol/L非必需氨基酸,2mmol/L谷氨酰胺,0.
1mmol/Lβ-巯基乙醇,knock-outDulbecco'smodifiedEagle'smedium(Invitrogen).
分化实验中,mESC预先在无MEF条件下传代两次以去除MEF细胞;这时培养中只有极少的MEF,mESC为克隆生长,有清晰的边缘.
这些细胞通常在40%~50%密度时进行去LIF分化实验或者外加因子刺激实验.
LW及Oct4-GFP小鼠胚胎干细胞系由UCLA的HongWu教授提供,Oct4-GFP细胞系由WhiteheadInstitute,MIT的RudolfJaenisch教授实验室建立.
1.
2克隆形成能力和胚样小体形成能力克隆形成能力的检测方法如下:1000个细胞在六孔板的孔内培养5~6天,培养条件同mESC,但是不加MEF.
细胞用4%PFA固定后,用NBT/BCIP(Sigma)染色碱性磷酸酶,计数阳性克隆的数量.
胚样小体的检测方法:1000个细胞培养在半固体培养基methylcellulose-basedsemi-solidmedium(R&Dsystems)中,5~6天后计数胚样小体.
每个实验都重复3次,以mESC的结果为对照.
1.
3基因表达分析细胞被吹打成单细胞悬液,用1*105个细胞提取mRNA,实验采用Cells-to-cDNAkit(Ambion),反转录用oligo(dT)18引物.
从胚样小体中提取mRNA时,细胞不消化悬浮,直接从单个胚样小体提取mRNA.
用PlatinumSYBRGreenqPCRSupermix-UDGwithROX(Invitrogen)在RocheLightCycler480上进行基因定量分析.
基因表达的变化情况用ΔΔCT方法分析,用18SrRNA的表达量校准.
可联系索取引物序列.
1.
4流式细胞分析(FACS)Oct4-GFP细胞经消化,成单细胞悬液在PBS中,用FACSScan通过cellquestsoftware(BDBiosciences)分析.
通过正面和侧面的光散射特征确认活细胞,LW系为阴性对照,读取GFP的荧光强度.
1.
5细胞因子处理,抗体阵列以及Westernblot(1)对LIF刺激实验,细胞预先在无LIF的培养液中维持2h以达到一个基础水平;2000U/mLLIF加入后,细胞在0min,15min和1h时间点分别收获,裂解.
对FGF8刺激实验,终浓度20ng/mL(R&Dsystems)以及1μg/mL的肝素(Sigma)直接加入培养液中混合均匀.
细胞裂解液直接用于R&DsystemsProteomeProfilerTMArray,humanphospho-MAPK抗体阵列分析,或者用Westernblot分析.
(2)对抗体阵列分析,1*107个细胞的裂解液被用于每一个抗体阵列膜的检测.
方法按说明书进行,即4℃过夜孵育,生物素标记的、磷酸化特异的二抗孵育,最后用HRP-avidin及化学荧光法显影.
每个斑点的强度通过ImageJ定量.
(3)Westernblot分析.
15μg蛋白裂解液用10%SDS-PAGE分离,电转到PVDF膜上.
所用一抗包括:Oct4(ChemiconAB3209),pERKThr202/Tyr204(CellSignallingTechnology9101),pp38Thr180/Tyr182(CST9216),pAktSer473(CST9271),pGSK3α/β,Ser21/9(CST9331),pβ-cateninSer33/37/Thr41(CST9561),pStat3Tyr705(SantaCruzsc-8059),pSmad1Ser463/465(CST9511),pSmad2Ser465/467(Zymed40-0800),以及Erk1(sc-94),Erk2(sc-154),p38(CST9212),Akt1/2(sc-1619),GSK3α/β(sc-7291),βcatenin(SigmaC2206),Stat3(sc-8019),Smad1(sc-6031),Smad2(sc-6032)和GAPDH(ChemiconMAB374).
HRP偶联的羊抗兔或者羊抗鼠二抗从SantaCruz生物技术公司购买.
膜显影采用Roche的BMChemilumin-escenceWesternBlottingKit.
显影结果经过扫描后用ImageJ定量.
https://engine.
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1360/zc2010-40-1-38乐志操等:细胞信号网络能灵敏地反映小鼠胚胎干细胞的早期分化402结果2.
1关键的干细胞分子标记表达情况不能揭示小鼠胚胎干细胞的早期分化白血病抑制因子(LIF)属于白介素类因子,被广泛应用于小鼠胚胎干细胞培养中.
如果从培养液中去除LIF,干细胞就开始分化,失去其干细胞能力[11,12].
这种细胞状态的变化,可以通过功能性检测定量的表达出来,如克隆形成能力和胚样小体的形成能力,(图1(A)及附图1),以及形成嵌合体小鼠的能力[13,14].
先前的研究也揭示了小鼠胚胎干细胞分化过程中的基因表达变化情况[13~16].
值得注意的是,在细胞分化的前两天,许多重要的干细胞标记基因,如Oct4/Sox2/Nanog/Stat3等均无明显的表达变化(图1(B)~(D)),而功能性检测却清楚地表明了干细胞能力的明显丢失.
进一步通过免疫染色的方法发现,在培养液中去除LIF4天后,细胞仍然表达Oct4/Sox2/Nanog/Ssea1/Stat3并持续有碱性磷酸酶的活力(图2).
最近Tbx3和Klf4被认为是连接LIF信号传导和干细胞核心转录因子网络Oct4/Sox2/Nanog的桥梁;但是同时,它们的表达情况与干细胞的状态本身并无相关性[17].
因此,尽管这一组分子标记被广泛应用于胚胎干细胞以及iPSC状态的确认,但它们并不能描述胚胎干细胞的早期分化.
对基因表达量的检测,反映的是细胞内特定分子的数量,但是它们在分子作用网络中的信息则未得到反映.
因此,基于表达量检测的方法不图1分子标记的表达不能反映小鼠胚胎干细胞的早期分化(A)克隆形成能力和胚样小体形成能力显示,去除LIF后1或2天,小鼠胚胎干细胞明显分化;(B)实时定量PCR检测细胞早期分化的基因表达变化情况.
横轴为胚胎干细胞表达的基准线.
去除LIF2天后,Oct4,Sox2及Nanog的表达无明显变化.
2倍变化由红线标出,5倍变化由蓝线标出;(C)Oct4-GFP胚胎干细胞系分化后,FACS分析表明在单细胞水平即使分化4天后GFP的表达变化很小;(D)Westernblot显示去除LIF4天后Oct4的蛋白表达水平无明显变化https://engine.
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1360/zc2010-40-1-38中国科学:生命科学2010年第40卷第1期41能足够灵敏地反映细胞状态的转换.
2.
2LIF激活的细胞信号网络情况能灵敏地反映小鼠胚胎干细胞的早期分化这里系统分析了小鼠胚胎干细胞分化过程中细胞信号网络的变化情况.
比较了干细胞状态,以及去除LIF培养2天后的细胞对LIF刺激的反应情况,因为功能性检测表明这时大部分的干细胞能力已经失去(图1(A)).
检查了8个信号节点的活力情况:Erk1/2,p38,Akt1/2,Gsk3α/β,Stat3,β-catenin,Smad1,Smad2;它们被认为是,调节干细胞活动的重要因子[18~23].
同时采用磷酸化特异的抗体阵列(R&DsystemsProteomeProfilerTMhumanMAPKarray)以及Westernblot的方法来互相印证结果(图3(A)和(B)).
同时确定了它们的总蛋白量基本无变化,因此被视为无明显变化(图3(B)及未显示结果).
数据定量的结果在图3(C)~(E)中,总结为图3(F).
在无外加刺激的安静状态下,信号节点的活力都很低(图3(C)).
LIF激活后,干细胞及分化两天的细胞的信号传导网络有显著差别(图3(D)).
已知LIF刺激会活化有不同功能的至少3个信号分支:Ras→Raf→MAPK途径,PI3-K→Akt途径,以及Jak→Stat3途径[20~22].
发现这些分支表现出不同的定量反应特征:(1)Stat3的活化差别大于5倍,这可能是细胞分化中的关键因素,因为细胞基本上失去了响应LIF刺激而磷酸化Stat3的能力;(2)分化后Erk1/2,Gsk3α/β和β-catenin的活力下降了,但是仍然在2倍范围内;(3)Akt1/2的活化情况未受影响.
对大部分的信号节点,它们的活力在1h后都回到了基础水平,与信号传导的一过性相一致(图3(E)).
总体来说,胚胎干细胞分化后,对LIF的反应能力下降了;这反映为信号传导途径中多个步骤的调节上,因此不同的分支表现了不同的定量反应特征:其中Jak→Stat3途径最为明显,Ras→Raf→MAPK途径影响不大,图2免疫组化表明干细胞标记在细胞分化后仍然表达干细胞分子标记包括Oct4(A-C)/Sox2(D-F)/Nanog(G-I)/Ssea1(J-L)/Stat3(M-O),以及碱性磷酸酶(P-R)的表达通过免疫组化和染色检测.
去除LIF4天后,这些标记分子仍然表达.
细胞核由DAPI染色确认https://engine.
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1360/zc2010-40-1-38乐志操等:细胞信号网络能灵敏地反映小鼠胚胎干细胞的早期分化42而PI3-K→Akt途径未受影响.
一个值得注意的情况是p38的反应.
有报道去掉LIF引起p38活化并导致小鼠胚胎干细胞程序性死亡[24].
本实验结果与此一致,同时发现在培养液中重新加入LIF会抑制p38的活力.
而且,尽管LIF刺激后β-catenin有明显磷酸化,但并未通过免疫组化检测到β-catenin的核转移(附图2).
这个发现的意义需要进一步探索.
而且,表征BMP/TGF-β信号传导的Smad1/2的活力在LIF刺激下并无变化,因此单一刺激因子不能活化细胞内的所有信号途径.
同时比较了干细胞及去除LIF分化一天后细胞间信号网络的差别情况,结果不如同两天分化后的比较明显(数据未显示).
因为本实验采用的是一种生化检测方法,表征的是一群细胞的特性,所以无法区分究竟在单细胞水平对LIF的反应情况是"模拟的"(即每个细胞都失去了一定百分比的反应能力),还是"数字的"(即在单细胞水平是0或1,但是在群体水平反映为一定的百分比).
总体来说,本实验表图3比较小鼠胚胎干细胞及去除LIF两天后的分化细胞间信号网络通过磷酸化特异的抗体阵列(A)以及Westernblot(B)的方法来检测细胞信号网络中多个节点的活力.
记录了基础水平(C)以及LIF刺激后两个时间点15min(D)、1h(E)的情况.
结果总结在(F)中.
每个实验都重复至少3次,得到相同的结果(n=3).
在抗体阵列上的19个激酶中,没有检测到JNK1/2/3,MSK2,RSK1/2,p70S6K和HSP27的活力.
在基础水平,大部分节点的活力都在一个低水平.
LIF刺激揭示了两种细胞状态反应能力的显著差别.
参见结果部分的更多描述https://engine.
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1360/zc2010-40-1-38中国科学:生命科学2010年第40卷第1期43明,通过检测细胞信号网络对LIF刺激的反应差别,能够明显表征干细胞去除LIF两天后的分化.
这比通过分子标记的方法要明显优越.
2.
3小鼠胚胎干细胞分化过程中通过FGF8激活细胞信号传导网络的情况前述对细胞信号传导情况的分析,可以通过用另一个因子FGF8激活情况得到进一步支持(图4).
发现,在有FGF8和Heparin的情况下:(1)Smad1/2的磷酸化被抑制(图4(C)),表明对BMP/TGF-β信号过程的干扰;(2)与LIF引起的一过性活化不同,FGF8引起Erk1/2,Gsk3α/β和β-catenin弱的,但是持续的活化.
FGF因子引起Erk的持续活化可能是一个广泛的现象[25,26];(3)Stat3的活力未受影响,表明在这个实验条件下Stat3的信号传导途径相对独立.
FGF8刺激后的信号网络活动情况未见显著差别,表明选择适当的刺激分子对揭示信号网络差别的重要性.
2.
4小鼠胚胎干细胞分化早期信号传导网络的不可逆改变前述关于信号传导网络的分析还揭示了为什么LIF不能"挽救"小鼠胚胎干细胞的分化.
在去除LIF后一天或两天,重新在培养液中添加LIF不能提高由功能性检测,包括克隆形成能力和胚样小体的形成能力(图5(A)和(B))所表征的干细胞的比例.
因为Stat3对维持小鼠干细胞功能的重要作用[27~29],这一发现可以被解释为去除LIF一段时间后,细胞不能重新对LIF刺激起反应而活化Stat3(图3).
因此,对细胞信号网络的分析,揭示了细胞分化过程中的关键调节步骤(图5(C)):在LIF刺激下Stat3的活化,对维持此一信号传导通路非常重要,其机制可能是通过一个正反馈来维持Stat3的表达,以及抑制信号传导途径抑制分子的表达.
去除LIF后,这一正反馈消失了,信号传导途径的抑制分子如Socs2被表达.
这些图4FGF8活化的小鼠胚胎干细胞信号网络比较小鼠胚胎干细胞和去除LIF两天后的一个早期分化状态的细胞.
用20ng/mLFGF8和1μg/mLheparin刺激,跟踪15min(A)和1h(B)两个时间点.
结果由抗体阵列检测得到,通过Westernblot(C)确认,并总结在(D)中.
实验重复3次,得到相同结果(n=3)https://engine.
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1360/zc2010-40-1-38乐志操等:细胞信号网络能灵敏地反映小鼠胚胎干细胞的早期分化44图5LIF能维持,但不能挽救小鼠胚胎干细胞的分化(A)和(B)功能检测表明,去除LIF1~2天后,重新在培养液中加入LIF两天,干细胞的比例未见改变;(C)一个描述小鼠胚胎干细胞不可逆分化的分子模型.
LIF活化多个细胞信号途径,其中Stat3的活化需要持续的LIF刺激.
一个正反馈机制维持Stat3的表达,并抑制信号途径抑制分子的表达.
去除LIF后,正反馈消失,信号传导的抑制分子被表达;其中主要作用是在Stat3分支上,而Akt或Erk分支受影响较少.
这导致细胞不能再对LIF反应而活化Stat3抑制分子的积累导致LIF不能重新活化Stat3.
目前对这些抑制分子的特征还不清楚,但是总的结果是干细胞的不可逆分化.
3讨论在此提出了通过分析细胞信号传导网络来表征细胞状态的一个新概念.
通过同时检测细胞内的多个信号网络节点,就能够揭示细胞内各种激酶的活力动态;它们表征的是多个信号传导途径的整合情况.
结果表明,这一方法比基于基因表达分析的方法能更灵敏地反映小鼠胚胎干细胞的早期分化.
这个方法可以被广泛应用于其他细胞类型(图6(A)).
通过一组外加刺激{s1,…,si,…,sj,…,sn},同时检测一组信号节点{p1,p2,…,pN}的动态活力变化情况,将能够构建细胞信号网络的整体特征{pk(si,t)},i=1,…,n,k=1,…,N.
这一特征,称之为细胞的"反应组",可能是细胞的一个基本特征,能够更精确的表征细胞的状态,并可能进一步应用于预测细胞对外加干扰和药物的反应.
而且,通过分析细胞分化过程中的"反应组"情况,还能够发现影响分化的关键步骤及调节因子(图6(B)).
对每一个节点,其活力变化情况可能通过以下3种方式调节:(1)上游活化信号增强了;(2)上游活化信号减弱了,比如信号途径的抑制图6简示分析细胞"反应组"的概念细胞信号网络的表征,通过一组外加刺激因子{s1,…,si,…,sj,…,sn},同时检测多个信号节点{p1,p2,…,pn}的活力随时间变化来实现.
细胞的"反应组"可能是细胞的一个基本特征,能更准确的实现细胞的确认;(B)每个信号节点活力的变化情况,可能通过以下3种方式:(1)上游信号增强;(2)上游信号减弱;(3)表达水平变化.
对关键节点的变化情况分析,可以揭示细胞分化早期的关键调节步骤https://engine.
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1360/zc2010-40-1-38中国科学:生命科学2010年第40卷第1期45因子被表达;(3)信号节点本身的表达变化.
这个分析方法揭示了细胞分化过程中的关键调节步骤.
而且,本实验结果还表明,信号传导网络的变化,要先于关键转录因子表达水平的调整.
因此,本研究发现支持如下概念,即信号传导调节细胞分化.
在这里,研究仅限于分析小鼠胚胎干细胞的早期分化,即干细胞→非干细胞的状态转换.
希望基于细胞信号传导网络的分析方法,将提供预测和控制胚胎干细胞定向分化的新手段.
这个方法的进一步发展,将有可能揭示关于细胞功能的更多方面.
致谢感谢UCLAHongWu实验室RongQiao和BahramValamehrBob提供技术帮助.
UCLA流式细胞分析中心的TammyPhung为FACS分析提供帮助.
USC的JingXu为定量PCR分析提供技术帮助,QilongYing教授提供宝贵意见.
参考文献1KellerG.
Embryonicstemcelldifferentiation:emergenceofanewerainbiologyandmedicine.
GenesDev,2005,19:1129—11552BrivanlouAH,GageFH,JaenischR,etal.
Stemcells.
Settingstandardsforhumanembryonicstemcells.
Science,2003,300:913—9163GilbertSF.
DevelopmentalBiology.
Sunderland(MA):SinauerAssociates,Inc.
20004HannaJ,MarkoulakiS,SchorderetP,etal.
DirectreprogrammingofterminallydifferentiatedmatureBlymphocytestopluripotency.
Cell,2008,133:250—2645TakahashiK,TanabeK,OhnukiM,etal.
Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.
Cell,2007,131:861—8726TakahashiK,YamanakaS.
Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.
Cell,2006,126:663—6767IrishJM,HovlandR,KrutzikPO,etal.
Singlecellprofilingofpotentiatedphospho-proteinnetworksincancercells.
Cell,2004,118:217—2288IrishJM,KotechaN,NolanGP.
Mappingnormalandcancercellsignallingnetworks:towardssingle-cellproteomics.
NatRevCancer,2006,6:146—1559JanesKA,AlbeckJG,GaudetS,etal.
Asystemsmodelofsignalingidentifiesamolecularbasissetforcytokine-inducedapoptosis.
Science,2005,310:1646—165310Miller-JensenK,JanesKA,BruggeJS,etal.
Commoneffectorprocessingmediatescell-specificresponsestostimuli.
Nature,2007,448:604—60811WilliamsRL,HiltonDJ,PeaseS,etal.
Myeloidleukaemiainhibitoryfactormaintainsthedevelopmentalpotentialofembryonicstemcells.
Nature,1988,336:684—68712SmithAG,HeathJK,DonaldsonDD,etal.
Inhibitionofpluripotentialembryonicstemcelldifferentiationbypurifiedpolypeptides.
Nature,1988,336:688—69013PalmqvistL,GloverCH,HsuL,etal.
Correlationofmurineembryonicstemcellgeneexpressionprofileswithfunctionalmeasuresofpluripotency.
StemCells,2005,23:663—68014GloverCH,MarinM,EavesCJ,etal.
Meta-analysisofdifferentiatingmouseembryonicstemcellgeneexpressionkineticsrevealsearlychangeofasmallgeneset.
PLoSComputBiol,2006,2:e15815SekkaD,GruelG,HerryM,etal.
MicroarrayanalysisofLIF/Stat3transcriptionaltargetsinembryonicstemcells.
StemCells,2005,23:1634—164216WalkerE,OhishiM,DaveyRE,etal.
Predictionandtestingofnoveltranscriptionalnetworksregulatingembryonicstemcellself-renewalhttps://engine.
scichina.
com/doi/10.
1360/zc2010-40-1-38乐志操等:细胞信号网络能灵敏地反映小鼠胚胎干细胞的早期分化46andcommitment.
CellStemCell,2007,1:71—8617NiwaH,OgawaK,ShimosatoD,etal.
AparallelcircuitforLIFsignalingpathwaysmaintainspluripotencyofmouseEScells.
Nature,2009,460:118—12218PrudhommeW,DaleyGQ,ZandstraP,etal.
Multivariateproteomicanalysisofmurineembryonicstemcellself-renewalversusdifferentiationsignaling.
ProcNatlAcadSciUSA,2004,101:2900—290519BurdonT,SmithA,SavatierP.
Signalling,cellcycleandpluripotencyinembryonicstemcells.
TrendsCellBiol,2002,12:432—43820ChambersI.
Themolecularbasisofpluripotencyinmouseembryonicstemcells.
CloningStemCells,2004,6:386—39121KristensenDM,KaliszM,NielsenJH.
Cytokinesignallinginembryonicstemcells.
APMIS,2005,113:756—77222ChuykinIA,LianguzovaMS,PospelovVA.
Signalingpathwaysregulatingproliferationofmouseembryonicstemcells.
CellTissueBiol,2007,1:191—20523YingQL,NicholsJ,ChambersI,etal.
BMPinductionofIdproteinssuppressesdifferentiationandsustainsembryonicstemcellself-renewalincollaborationwithSTAT3.
Cell,2003,115:281—29224DuvalD,ReinhardtB,KedingerC,etal.
Roleofsuppressorsofcytokinesignaling(Socs)inleukemiainhibitoryfactor(LIF)-dependentembryonicstemcellsurvival.
FASEBJ,2000,14:1577—158425EswarakumarVP,LaxI,SchlessingerJ.
Cellularsignalingbyfibroblastgrowthfactorreceptors.
CytokineGrowthFactorRev,2005,16:139—14926TsangM,DawidIB.
PromotionandattenuationofFGFsignalingthroughtheRas-MAPKpathway.
SciSTKE,2004,228:pe1727RazR,LeeCK,CannizzaroLA,etal.
EssentialroleofSTAT3forembryonicstemcellpluripotency.
ProcNatlAcadSciUSA,1999,96:2846—285128MatsudaT,NakamuraT,NakaoK,etal.
STAT3activationissufficienttomaintainanundifferentiatedStateofmouseembryonicstemcells.
EMBOJ,1999,18:4261—426929NiwaH,BurdonT,ChambersI,etal.
Self-renewalofpluripotentembryonicstemcellsismediatedviaactivationofSTAT3.
GenesDev,1998,12:2048—2060附图1小鼠胚胎干细胞分化过程中的形态变化https://engine.
scichina.
com/doi/10.
1360/zc2010-40-1-38中国科学:生命科学2010年第40卷第1期47附图2小鼠胚胎干细胞中β-catenin的定位LIF刺激后细胞中β-catenin的定位情况.
尽管β-catenin的磷酸化情况变化明显,但未观察到核转移的变化.
细胞用-20C的甲醇固定,用Sigma(C2266)抗体做免疫荧光检测.
细胞核用DAPI染色https://engine.
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