抗体俄病毒研究所爆炸

z一第t0卷第3期1995年9月中国病毒学VmOLOGICASINICA67670V01.
10.
No.
3seD.
,】995用免疫学技术研究两种颗粒体病毒的亲缘关系外自然罹病死亡的幼虫尸中分离获得,依据病毒各自分离寄主种名而分别定名.
随后分别对病毒各自的特性和生物防治应用进行了研究.
AeGV和AsGV除对各自分离寄主有较强感染性外,相互间亦可交叉感染一.
由于惊纹鸣夜蛾和黄地老虎食性相同、虫情发生期重叠,现有资料均未涉及这两种病毒的亲缘关系,很难排除一种病毒流行感染两种寄主而分别定名的可能性.
因此,以经典的免疫学检测技术研究这两种病毒间的亲缘关系,不但可以对这两种病毒的分类鉴定提供重要补充材料,还可以为探讨病毒种的遗传与进化积累不可多得的实验资料.
本文报道用琼脂糖双扩散、对流免疫电泳,DotELISA和线免疫电泳技术检测的结果材料与方法1材料l_I病毒AeGV,病毒种编号AS-IVL.
1,为中国菌保会普通病毒中心收集的病毒原种、系新疆巴音郭楞自治州农科所提供.
病毒AsGV编号AS·IV1.
2,系新疆农科院徽生物所提供给普通病毒中心的首批原毒种.
1-2免疫用动物为普通级昆明种小白鼠18--22g/只,由所謇验动物室提供.
t.
3致腹水肉瘤细胞【S),赡自中国兽药监察所,使用浓度约为2*1&c~ll/ml.
1.
4辣根过氧化物酶标羊抗鼠IgG,赡自华美生物=I二程公司.
I-5琼脂糖赡自上海化学试荆采购站.
3+3-二氨基联苯胺(DAB),购自Sigma公司.
I.
6q∞.
45~rn镦孔滤膜,赡自上海新亚净化器件f.
.
2方法2.
IGV的提纯虫尸经研磨稀释、过滤,差异离心去杂质,0.
3熵Ds去污,蔗糖梯度离心纯化,脱培后配制成湿重20mg/ral的GV悬浮液,4℃藏备用2·2小白鼠愎水抗体制备GV贮备液加荨量O.
Imol/L,NaCOs.
0.
05mol/LNaCI,pH10.
6碱液,室温碱车立于1994年6爿2日收到,1995年3月24日修回·薛罩蝽、熊克娟、刘慢新二同志参加过部分预备试验维普资讯http://www.
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com266中国病毒学第l0卷解.
GV悬浮液由乳白色明显变灰暗时即用lmol/LHCI中和至pH8.
0左右.
首抗免疫时加入等休积福氏完全佐荆.
每鼠腹腔注射0.
5ml,以后免疫改加不完全福氏佐荆,每周免疫一l{:一免疲量每次递增0·】ml,共免4--5次.
最后一次免疫的第二天腹腔注入5--0.
7mls椰细胞.
注s∞细胞后的第8—10天抽取腹水·低速离心.
收集上清加NaN,,℃保存备用.
2.
3琼腊睹腔双扩散1%睹c脂糖腔,以0.
05tool,L硼酸缓冲藏pH喜.
6配{嚼.
抗体孔加入抗AeG'V和抗AsGV腹水各芈,共30mi,抗原孔分剐加入AcGV和AsGV,每孔P.
,Sm1.
37℃孵育24h.
2.
抗原交叉吸收及检测以过量病毒抗原吸收腹水中的病毒抗体后一用对流免疫电泳和Dot—ELISA控栽吸收后腹水中抗体组分.
以抗原与相对应的抗病毒嚏水作阳性对照,对照用I良永稀释度与l叟叉吸收后的腹水稀释度相当.
DotELISA另以币加抗体的抗原作阴f-f-f-f-f-f-f-f-f-f~照,显色荆为DAB.
2.
5线免疫电泳参照话家秀方法盎行,电泳液改为o.
02tool,L硼酸缓冲藏(pH8.
6).
20V条件下电泳l砘.
最岳经氰基黑一10B染色.
结果l琼脂糖胶双扩散结果如图l.
在混和腹水抗体与两种抗原之间形成一条明显的、完全融合的沉淀线,说明两种GV具相同抗原.
2抗原交叉吸收抗体试验图2显示抗体吸收不完全的对流免疫电泳检测结果,从抗原抗体孔同沉淀线的明显情况可看出未经吸收抗体的腹水与交叉抗原有最强的抗原抗体反应;lfi『吸收抗体后的腹水与相应抗原存在弱的抗原抗体反应时,与交叉抗原亦产生较弱的抗原抗体反应.
图3显示过量抗原交叉吸收抗体后的腹水用对流免疫电泳检测,再经氨基黑】.
B染色的结果.
说明腹水中抗体经交叉抗原吸收后,用对流免疫电泳已不能检出.
图4为DotELISA,检测相同样品的结果.
亦印证了对流免疫电泳的检测结果,说明两病毒具有相同抗原.
3线免疫电泳试验结果如图5.
AeGV与AsGV各与相应的腹水抗体形成三条沉淀区带,两GV的沉淀区带分剐互相连结,说明两病毒的抗原组分具有同谭性.
讨论甩经典的琼脂糖胶双扩散技术检测AeGV与AsGV,认为两病毒抗原性相同,即使采用对流免疫电泳和Dot—ELISA技术检测交叉抗原吸收后的腹水抗体组分,也未发现二者之r白J存在抗原组分的显著差异.
血清学性质是物种重要特性之一,因此可以认为AeGV与AsGV具有密切的亲缘关系.
线免疫电泳结果指出AeGV与AsGV各育三种抗原组分,各组分的沉淀线分别连接,亦证明两病毒抗原纽分的同源性,两病毒相连的沉淀线位置高低有明显差别,这与电泳时使用的抗原抗体比例小一致有直接关系同一病毒出现沉淀线的探浅一,是使用的抗原组分间浓度差异所致A~elson首创的线免疫电泳技术对于分析抗原或抗体组分、特异抗原(或抗体)检测及未知抗原(或抗体)检测都是很灵敏准确的方法,且具有在相同抗原(或抗体)条件F,比较待测抗体(或抗原)量的作用.
然而,在我国昆虫病毒和植物病毒研究中心至今未见有过应用报道.
笔者认为用此技术普查病毒种问的亲缘关系或研究病毒自身抗原组成是方便而灵敏的方法.
小白鼠腹水抗体在病毒粒子、病毒衣壳或来源困难的病毒抗原免疫研究中是很适用的,但在我国昆虫病毒、植物病毒免疫研究中亦应用不多.
考虑到同免疫动物对同一抗原的应答反应有差异嘲,多克隆的抗原抗体检测难以发现维普资讯http://www.
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com第3期杨明辉等:用免疰学技术研究两种颗粒体病毒韵亲缘关系257AGv和AgGV抗原性质的细小差别,应用单克隆抗体检测二青抗原同一性的研究正在进行之中.
5图】琼脂糖臆驭扩散检测(】琼脂糖.
&5m霜酸缓冲波pH86)抗原;A(AeGV)'B(AsGV).
挽体:c(AeGV腹水+AsGV喧水).
图2对瓶免疫电泺检{嘲'展示AeGV和AsOV的交1曼免,芷反应和束完成的交¨蔓暇收试验.
抗砸:I3.
5(AeGV){2.
4.
6(AsGV.
AsGV捷体;日【吸收前)油、c(吸收后)aAeGV砷{f【吸收莳1ld、e(吸收后图3对壳免疫电珏=检{嘲(展示完成曲交)L吸收试验.
电珏=后脏经O.
5%氰基黑]oH染色1抗j贰:1.
3(AcGV)f2.
4(AsOV).
AgGV抗体:a:来暖收,稀释度如b:吸收后的^sGv抗体,c;素吸收的,稀释腰如d,d:吸收后的.
图4斑丧一酵联免疫暇酣检{嘲.
圈中CK、A、R舟*力图3中2,3_b郸4-d样品、ck一:AsGV抗聒c、无挠体.
圈5线免痤电诛检i匿i抗娘:H;(AsGV)4c(AeGV),抗体:A(AsGV十AcGV)F蝤lAgrosegeldouble-diffusionte1.
(f%agroae0.
OSmol/Lboralbuffcr.
pH8.
6)AnIcn:Ac^eGV).
H(AsGV).
Antibody:C(AcGV8~il+AsGVascites).
F醇2Cou~lcr_modec【r婶h0tcsIlestlchowodthe盯键B~mmuneres0o~s~betweenAeGVRndAsGV.
andai~-orotcr∞sabsorptionexpedrnentAntigen:I.
3.
5(AeGV)#2,4.
6(AsGV).
AntibodyofAsGV:a(Ooforclbeabsorption)cb.
c(afterthe~bsorp-维普资讯http://www.
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com268中国病毒学第10卷Fig3tion).
ArltibodyofAeOV:f(bef0theabsorptinn)#d.
e(ancrIa呐.
rpInCounterlmmun0clectpboesBt雌IItshowedthec0mpk05%em~no-b]ackIOBafterIheelectr0Dhorcs一~r~ss-absorptioncxperlmentTheB日wRsstamodbyAnt远eI.
3(AcOV);2.
4(AsGV1.
AcGVantibody:a(unabsorbem—itsdilutionb)}b(a~erabsIdilutionaBd;d(afterabsorption~Fig4Dot.
ELISAtest.
TheCK.
AandBathesamplesof2-e一3-t)一and4-dinFigrenpeetively.
ck一;AsC~Vanlbgen·noamibody.
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,Acaderaia8ir,ica.
Wuhan430071)In1977and1978+Arotiselumgranulosisvirus(AsGV)andAgrotisezetamationisgranulosisvirus(AeGV)wereisolatedfromtheirhoscrespectivelyinXinj~angprovince.
Bothofthemcanalsoinfecttheotherisolatedhost.
TheimmunologicalrelationshipbetweenAsGVandAeGVwastestedwi[hagarosedouble-diffusiontcounterimmunoelectrophoresistDot—ELISAandlineimmunoelectrophoresistechniquesinthisarticle.
TheresultsshowedaveryclosereIatiOilsh_Dbetweenchetw0viruses.
Theeffectivenessoflineimmunoelec—trophoresistechniquewasdiscussed.
KeywordsAgroti,sseq札mgranuclosisvirus,AgvotiseⅡmat,ion.
isgranulosisvirus,MoUSe~CiteSantibody.
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com