cdna是什么什么是牛瘟和牛瘟病毒和应怎样诊断？

什么叫做DNA重组

. 目的基因的获得。

从细菌或动植物细胞中取出染色体的DNA，用内切酶将之切成若干片段，从中鉴定出目的基因。

另一种方法是从细胞中分离到信使核糖核酸核(mRNA)用反转录酶的作用获得该基因的互补DNA(cDNA)。

如果预先知道某种蛋白质的氨基酸顺序，可以破译它的遗传密码，用DNA合成的方法获得基因。

2. 运载体的选择。

运载体一般为质粒，是细菌中染色体以外的DNA。

但它不是正常的成分，即没有质粒也完全可以正常生长。

质粒是环状的DNA，能自主复制，有若干内切酶切口和某些抗生素的抗药性基因。

可以作为转基因的载体。

3. 内切酶切割。

将目的基因与质粒DNA如pBR322质粒，用相同的内切酶分别进行切割，结果它们都会形成相同的切口。

4. 连接酶连接。

DNA连接酶，常用的有T4。

在三磷酸腺苷(ATP)及镁离子存在的条件下，T4连接酶能将切口相同的两种DNA连接起来，形成一个插入目的基因的质粒，叫重组质粒。

5. 宿主菌。

宿主菌如大肠杆菌作为受体菌，需要培养到旺盛生长阶段，叫感受态细胞。

一般在液体培养基中，37℃振荡培养过夜即可。

6. 重组DNA的转化。

将插入目的基因的质粒加入呈感受态的大肠杆菌中，同时加入适当的钙盐(Ca+2)，振荡培养。

大肠杆菌将重组质粒吞入胞内。

这个过程叫转化。

7. 转化子的筛选。

pBR322质粒的PstI酶切口处插入目的基因时，则会破坏了抗氨苄青霉素的基因。

将转化后的大肠杆菌单个菌落，挑取菌体分别接种于含氨苄青霉素及链霉素的培养基中。

如在链霉素培养基上生长而在氨苄青霉素培养基上不能生长的菌落即为转化子

什么是逆转录酶？

逆转录酶(reversetranscriptase)又称为依赖RNA的DNA聚合酶。

1970年很多研究者从一些致癌RNA病毒中发现这种酶，该酶催化以单链RNA为模板生成双链DNA的反应。

由于这一反应中的遗传信息的流动方向正好与绝大多数生物转录生成方向(即DNA模板转录生成RNA的方向)相反，所以此反应称为逆转录作用。

逆转录酶具有三种酶活性：①RNA指导的DNA合成反应；②DNA指导的DNA合成的反应；③RNA的水解的反应。

基因工程中有两种商品化的逆转录酶：一种来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(avianmyoblastosisvirus,AMV)提取的；另一种是Moloney鼠白血病病毒(moloneymurineleukemiavirus,Mo-MLV)克隆的逆转录酶编码基因在大肠杆菌的表达产物。

这两种逆转录酶有一些区别，禽源逆转录酸在42℃(鸡的正常体温)能有效发挥作用，而鼠源逆转录酶在42℃时则迅速失活。

禽源逆转录酶能更有效地拷贝较复杂的mRNA。

禽源逆转录酶和鼠源逆转录酶均属多功能酶，它们的共同性质是：①具有RNA指导的DNA聚合酶活性，可以RNA为模板，以寡聚脱氧核糖核苷酸为引物，合成互补的DNA(cDNA)；②具有DNA指导的DNA聚合酶活性，但不具DNA聚合酶那样的3′→5′外切酶活性；③具有RNaseH活性，即从5′或3端连续地降解RNA：DNA杂种双链中的RNA部分。

在基因工程中，逆转录酶的主要用途是：①将真核基因的mRNA转录成cDNA，构建cDNA文库，进行克隆实验；②对具有5′突出端的DNA片段的3′端进行填补(补平反应)和标记，制备探针；③代替Klenow大片段，用于DNA序列测定。

逆转录病毒是什么？

逆转录病毒即RNA病毒，需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增的一类病毒。

逆转录病毒是RNA病毒，它有三个基因：gag-编码病毒的核心蛋白；pol-编码逆转录酶；env-编码病毒的被膜糖蛋白。

有的逆转录病毒还带有癌基因（vonc），即有的逆转录病毒有致癌作用。

近年来，已设计构建成一些缺陷型病毒（defective virus）使逆转录病毒成为有用的基因载体，成功地把抗药性基因转入了人体造血前体细胞，并在细胞中表达。

Hock等选用了缺失编码病毒外壳蛋白基因的逆转录病毒，因此不能合成自身的外壳，但它有识别外壳蛋白进行包装的信号（一段尚未鉴定的DNA顺序）。

用这种缺陷的逆转录病毒去感染某种细胞株，这种细胞株包含有辅助病毒（helper virus）。

辅助病毒能合成蛋白外壳，但缺失了识别蛋白外壳进行包装的信号，因此它不能包装成病毒颗粒。

当用逆转录病毒感染细胞株后，逆转录病毒的RNA进入辅助病毒的外壳蛋白，成为病毒颗粒。

这时把受感染的细胞同骨髓细胞一起培养，包装在辅助病毒外壳蛋白中的逆转录病毒RNA，进入骨髓细胞，病毒DNA插入宿主细胞基因组，基因的活性得到表达。

这时，由于骨髓细胞里面没有辅助病毒，所以整合进宿主基因组的逆转录病毒，不再有外壳蛋白可供包装，因此也就无法增殖，而只能被“陷”在宿主基因组中，通过细胞分裂而传给下一代子细胞。

1970年科学家在致癌RNA病毒中发现一种特殊的RNA病毒聚合酶，该酶能以RNA为模板，根据碱基互补原则。

这一过程与一般病毒转录方向相反，故称逆转录，催化此过程的酶称为逆转录酶,后来发现在哺乳动物的胚胎细胞和正分裂的淋巴细胞也含有。

逆转录病毒又称为携带逆转录酶的病毒，它先侵入宿主细胞以病毒RNA为模板，靠酶形成DNA环化，然后合到宿主细胞的染色体中去以原病毒形式在宿主细胞中一代代传下去。

【逆转录病毒分类】 按照目前国际病毒分类标准，逆转录病毒科分为7个属： α逆转录病毒属 Alpharetrovirus β逆转录病毒属 Betaretrovirus γ反转录病毒属 Gammaretrovirus δ反转录病毒属 Deltaretrovirus ε反转录病毒属 Epsilonretrovirus 慢病毒属 Lentivirus 泡沫病毒属 Spumavirus 其中的慢病毒属又分为5个组，包括牛慢病毒组、马慢病毒组、猫慢病毒组、羊慢病毒组和人类慢病毒组。

HIV在病毒“大家族”中的定位是逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组。

根据生物学的分类，逆转录病毒可以分为7个属，在这些病毒当中我们最熟悉的是人类免疫综合症（HIV）。

HIV在病毒“大家族”中的定位是逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组。

【逆转录病毒和基因治疗】 从1990年美国施行第一例基因治疗计划到目前为止，全世界共有几百例临床计划在实施中。

当初人们对基因治疗普遍寄予厚望，但结果却往往不尽如人意。

人们意识到在基因组、基因的表达调控及疾病发生的机理没有彻底阐明之前，基因治疗还很难取得突破性进展。

但基因治疗的出现，毕竟给我们治疗一些用传统疗法难以治愈的疾病带来了新的希望。

逆转录病毒载体 逆转录病毒的许多特点使其成为基因转移载体的上佳选择。

最重要的一点是它可以有效的整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。

病毒基因组以转座的方式整合，其基因组不会发生重排，因此所携带的外源基因也不会改变。

而另一类整合载体——腺相关病毒，以同源重组的方式整合，整合过程中病毒基因组发生重排，可能会影响到外源基因的结构与功能 如果能实现有效的基因转移，基因治疗在对付遗传性疾病、减缓肿瘤发展、战胜病毒性感染和终止神经系统退行性病变等方面都会有广阔的应用前景。

这就要求在载体改造、载体的靶向性、外源基因的表达调控等诸多方面取得显著进展。

基因转移载体可分两大类：病毒性载体和非病毒性载体。

非病毒性载体的方法包括裸DNA注射、基因枪法、多聚赖氨酸或阳离子脂质体包裹DNA法等。

一般非病毒性载体毒性成分少，且较安全。

但它们存在共同的弱点：效率低且携带基因表达时间短。

所以目前研究仍是一些病毒性载体，如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等。

逆转录病毒应用最早，研究也相当成熟，目前仍被广泛应用。

慢病毒也是一类逆转录病毒，它表现出的一些特点使人们对其逐渐产生了兴趣。

逆转录病毒的许多特点使其成为基因转移载体的上佳选择。

最重要的一点是它可以有效的整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。

病毒基因组以转座的方式整合，其基因组不会发生重排，因此所携带的外源基因也不会改变。

而另一类整合载体——腺相关病毒，以同源重组的方式整合，整合过程中病毒基因组发生重排，可能会影响到外源基因的结构与功能。

逆转录病毒的靶向性 逆转录病毒可以与多种细胞表面蛋白结合而进入细胞，其宿主细胞范围很广。

逆转录病毒的亲嗜性存在物种之间的差异，据此可将其分为三类：(1)单嗜性逆转录病毒(ectropic retrovirus)，只感染小鼠和少数几个品种的大鼠；(2)兼嗜性逆转录病毒(amphotropic retrovius)，能感染小鼠的细胞，也能感染其他种属动物的细胞；(3)异嗜性逆转录病毒(xenotropic retrovirus)，能感染多种动物细胞，但不能感染小鼠细胞。

目前使用较多的是兼嗜性逆转录病毒，即以兼嗜性包装细胞包装病毒颗粒。

逆转录病毒的宿主范围由病毒颗粒表面的包被蛋白(Env)决定，病毒基因组不影响其靶向性，不同的基因组可用相同的Env包被，且Env来自何种病毒，包装出的病毒颗粒就叫该病毒的假病毒。

通过改变Env蛋白可以改变载体的靶向性。

如用水泡性口炎病毒的G蛋白包装逆转录病毒基因组产生假病毒(pseudotype)，可拓展逆转录病毒的靶细胞范围并赋予病毒颗粒新的特性。

兼嗜性逆转录病毒一般结合细胞表面的磷酸转运体而进入细胞，但有一些重要的靶细胞：淋巴细胞、早期造血干细胞磷酸转运体的表达水平很低，而导致载体对其转导效率低下。

G蛋白包装的假病毒则得有效感染这些细胞。

这种假病毒还可以用超速离心进行浓缩达到很高的滴度(109 cfu/ml)，普通的逆转录病毒只能达到106 cfu/ml；G蛋白还能抵抗人类补体的灭活作用，使其适于作体内(in vivo)的基因转移。

为提高逆转录病毒感染靶细胞的特异性，还可以在原来的病毒Env蛋白上接上一段具有特异靶向的多肽，目前应用较多的是单链可变区抗体(scFv)。

如Martin等设计的特异靶向黑色素瘤细胞的逆转录病毒。

他们在病毒包被糖蛋白的表面结构域(SU)上依次接上间质金属蛋白酶的酶切位点、一段富含脯氨酸的肽段及一段特异识别高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)的SCFU。

90%的人黑色素瘤细胞高水平表达HMW-MAA这一穿膜分子，而绝大多数成人组织不表达。

富含脯氨酸的肽段则暂时阻端SU和磷酸转运体的结合。

肿瘤细胞表面还有高表达的间质金属蛋白酶，它在肿瘤细胞对正常组织的侵入中发挥重要作用。

这样改造过的载体在SCFV的导向下达到肿瘤部位，肿瘤细胞表面的金属蛋白酸切去SU上的SCFV和脯氨酸肽段，SU和肿瘤细胞表面的磷酸转运体结合，进入肿瘤细胞，从而大大提高了载体靶向的特异性。

逆转录病毒载体感染非分裂细胞的探索 具有感染终末分化细胞的能力，高的转导效率和持续且可控制的基因表达是理想的基因治疗载体的三大特点。

逆转录病毒虽具有后面两个优点，但不能感染非分裂细胞如肌肉、大脑、肺及肝组织中的这些可以做为基因治疗靶细胞的重要细胞。

由于逆转录病毒的复制特点，它感染细胞时，细胞分裂需处于DNA合成阶段。

因此有人尝试使用组织损伤或部分切除来诱导靶细胞分裂。

例如肝脏部分切除可以极大地提高逆转录病毒在肝内的转导效率。

还有一种途径是利用一些基因的产物来诱导间歇期细胞进行DNA复制来增强逆转录病毒的感染。

SV40的大T抗原可以诱导终末分化的肌肉细胞进行DNA复制和细胞分裂。

表达温度敏感的大T抗原的肝细胞可被逆转录病毒高效感染。

用巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)预先刺激间歇期细胞也可以大大增强逆转录病毒载体的感染效率。

逆转录病毒载体表达的调控 有人用ex vivo的方法，在肌细胞中表达IX因子，治疗小鼠血友病B。

发现感染细胞回输小鼠后5～7d，IX因子的表达即被“关闭”了。

证明不是由于细胞丢失、基因删除或免疫机制的原因。

而可能是由于持续表达的外源基因诱导机体对其进行修饰而失去表达，因此要求基因在诱导物的作用下短暂表达，目前使用较多的有四环素诱导调控系统和雌激素诱导调控系统等。

除此之外增强与启动子的正确组合也能避免基因表达被关闭。

仍以上例，若用ATP肌酸磷酸转移酶的增强子——启动子来控制外源基因表达，只能得到低水平的表达，换用ATP肌酸磷酸转移酶增强子——巨细胞病毒启动子的嵌合载体，外源基因的表达可以持续两年。

寻找载体调控元件的合理组合需长期摸索，在多基因载体中这种任务显得更加艰巨。

什么是牛瘟和牛瘟病毒和应怎样诊断？

牛瘟和牛瘟病毒及其诊断 牛瘟又名烂肠瘟，胆胀瘟，是由牛瘟病毒所引起的一种急性高度接触传染性传染病，其临床特征表现为体温升高，病程短，黏膜特别是消化道黏膜发炎，出血，糜烂和坏死。

OIE将其列为A类疫病。

病原 牛瘟（Rinderpest，cattle plague或steppe murrain）病毒，是一种具感染性的牛只病毒，会引起牛瘟。

这种病毒性疾病主要传染于水牛之间，但其他野生品种也有致病的记录。

症状是牛发生高烧，口部溃烂，腹泻，淋巴坏死，有很高的致死率。

病毒比较脆弱，干燥曝晒易灭活病毒，但在湿冷或冷冻的组织中可存活很长时间。

56℃60分钟或60℃30分钟能被灭活，但少数病毒能抵抗。

在pH4.O～10.0之间稳定。

对脂溶剂敏感。

对多数普通消毒剂如石炭酸、甲酚、氢氧化钠敏感。

牛、牦牛、水牛、瘤牛，以及野生动物(非洲水牛、非洲大羚羊、大弯角羚、角马、各种羚羊、豪猪、疣猪、长颈鹿)等，不分年龄和性别对本病均易感，尤以牦牛最易感，黄牛和水牛次之。

其他动物如绵羊、山羊、鹿以及猪也易感。

亚洲猪比欧洲、非洲猪易感；骆驼科动物极少感染。

病毒经消化道传染，也可经呼吸道、眼结膜、上皮组织等途径侵入。

主要通过直接接触传染，也可通过密切接触的物体、昆虫间接传播，但不是主要方式。

病牛为主要传染源。

潜伏期病牛(发热期前1～2天)的眼、鼻分泌物，唾液，尿液及粪便；临床症状出现前感染牛的血液及昕有组织均具传染性。

该病具明显的周期性和季节性，以12月份和次年4月份间为流行季节。

具很高的发病率及死亡率，发病率近100%，病死率可高达90%以上，一般为25%～50%。

发病机理牛瘟病毒通过消化道侵入血液和淋巴组织，主要在脾和淋巴结中迅速繁殖，然后传遍全身各组织内。

一般在病牛发热前一天出现病毒血症，动物体温越高，血中含毒量越大；约在中等浓度时，可引起宿主的组织变化，出现症状。

牛瘟病毒主要破坏上皮细胞，对淋巴细胞具有同样的选择亲和性，并予以破坏。

临床症状潜伏期一般为3～15天。

《陆生动物卫生法典》规定，牛瘟的潜伏期为21天。

急性型：新发地区、青年牛及新生牛常呈最急性发作，无任何前驱症状死亡。

病畜突然高热(41～42℃)，稽留3～5天不退。

黏膜(如眼结膜，鼻、口腔、性器官黏膜)充血潮红。

流泪流涕流涎，呈黏脓状。

在发热后第3～4天口腔出现特征性变化，口腔黏膜(齿龈、唇内侧、舌腹面)黏膜潮红，迅速发生大量灰黄色粟粒大突起，状如撒层麸皮，互相融合形成灰黄色假膜，脱落后露出糜烂或坏死，呈现形状不规则、边缘不整齐、底部深红色的烂斑，俗称地图样烂斑。

高热过后严重腹泻，里急后重，粪稀如浓汤带血，恶臭异常，内含黏膜和坏死组织碎片。

尿频，色呈黄红或黑红。

从腹泻起病情急剧恶化，迅速脱水、消瘦和衰竭，不久死亡。

病程一般4～10天。

非典型及隐性型：长期流行地区多呈非典型性，病牛仅呈短暂的轻微发热、腹泻和口腔变化，死亡率低。

或呈无症状隐性经过。

病理变化牛瘟病毒对上皮细胞和淋巴细胞有亲和性，所有淋巴器官损害严重，特别是肠系膜和与肠有关的淋巴组织。

典型病例尸体外观呈脱水、消瘦、污秽和恶臭。

剖检可见消化道黏膜严重炎症并坏死，口腔、第四胃、肠道、上呼吸道黏膜坏死、糜烂，或充血、出血。

小肠黏膜潮红、水肿，有出血点；淋巴结肿胀、坏死。

大肠呈程度不同的出血或烂斑，覆盖灰黄色假膜，形成特征性的“斑马条纹”。

胆囊增大1～2倍，充满大量绿色稀薄胆汁，黏膜有出血点。

淋巴结水肿肿胀。

诊断，实验室诊断 在国际贸易中检测的指定诊断方法为酶联免疫吸附试验，替代诊断方法为病毒中和试验。

病原鉴定：用于抗原检测方法有琼脂凝胶免疫扩散试验、直接和间接免疫过氧化物酶试验、对流免疫电泳；用于病毒分离和鉴定方法有病毒分离、病毒中和试验；用于检测病毒RNA方法有牛瘟特异性cDNA探针和PCR扩增。

血清学试验：酶联免疫吸附试验(ELISA)、病毒中和试验。

病料采集：用于病原分离鉴定宜采集全血，加肝素(10IU/毫升)或EDTA(0．5毫克/毫升)抗凝，置冰上(但不能冻结)送检；或刚死亡动物的脾、肩前或肠系膜淋巴结，置O℃以下保存待检；眼、鼻分泌物拭子(在前驱期或糜烂期采集)。

用于血清学检验宜采集血清。

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(本文摘自：中国禽畜网)