质粒临床分离嗜麦芽寡养单胞菌l1、l2酶基因克隆、测序及定位

临床分离嗜麦芽寡养单胞菌L1 、L2酶基因克

隆、测序及定位

【关键词】 β

摘要 目的了解临床分离嗜麦芽寡养单胞菌产L1、 L2 β内酰胺酶情况、酶基因定位及核苷酸序列进化和同源关系。方法PCR法扩增两种β内酰胺酶基因通过克隆、测序、序列比对确定其亚型、基因进化、同源关系和基因所在位置。结果细菌染色体DNA和质粒DNA扩增L1、 L2酶基因阳性其序列具有明显异质性两种酶基因位于12kb大小的质粒上。结论嗜麦芽寡养单胞菌绝大多数产生两种β内酰胺酶酶基因变异和进化加速的驱动力部分可能与β内酰胺类抗生素的长期使用有关。

关键词 β内酰胺酶 异质性 质粒

Cloning, sequencing and location of genes encodingL1 andL2 βlactamases

ABSTRACT Objectives To investigate the production of L1 andL2 β lactamases, location and evolution or homology ofnucleotide sequences of their encoding genes in clinicalisolates of Stenotrophomonas maltophilia.Methods Two β

精品lactamasesencoding genes were amplified by PCR. Thesubtypes, evolution or homology and location of genes weredetermined by gene cloning, sequencing and sequencescontrasting. Results L1 andL2 genes in chromosomes and plasmidswere amplified, the gene sequences were apparentlyheterogeneous and the genes were located on 12kb plasmid.Conclusion Majority of Stenotrophomonas maltophilia isolatesproduced two β lactamases. Gene variation and evolutionacceleration partly contributed to longtime uses of βlactams.

KEY WORDS β lactamases; Molecular heterogeneity;Plasmids

嗜麦芽寡养单胞菌(又称嗜麦芽窄食单胞菌)为机会致病菌广泛分布于自然界医院环境和医务人员皮肤分离率较高。随着医源性介入技术的应用、免疫抑制病人的增加以及抗生素的大量使用增加了该菌的感染机会。该菌耐药性强对临床多种抗生素包括多数β内酰胺类耐药是目前医院内感染的重要致病菌之一对β内酰胺类抗生素耐药主要因该菌产生两种β内酰胺酶(L1和L2酶)所致。本文从临床标本中收集13株嗜麦芽寡养单胞菌研究其产两种β内酰胺酶的情况及酶基因位置探讨耐药性产生的原因。

1材料和方法

1. 1菌株所有菌株来源于2003年3月2004年7月解放军总医院的临床标本 由该院微生物科分离、培养、鉴定并保存。本次实验前所有菌株均经VITEK微生物鉴定系统重新鉴定药敏试验应用复方磺胺甲口恶唑(SMZ/TMP) 、亚胺培南(IMP) 、左氧氟沙星(LVL X)和头孢他啶(CAZ)4种抗生素纸片并采用纸片扩散法进行常规药敏试验耐药的判定点参照CLSI/NCCLS(2000年)标准。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853和大肠埃希菌ATCC25922。

1.2质粒DNA的提取将13株临床菌株37℃过夜培养后分别挑取12个菌落接种在5ml LB培养基中 220r/min 37℃恒温摇床孵育12h采用碱裂解法抽提质粒DNA 1粗提物5μl直接加样于08%琼脂糖凝胶上电泳检测溴化乙啶染色后收集图像。

1.3染色体DNA的提取取上述菌液2ml采用天为时代离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒提取染色体DNA。

1.4 L1、 L2酶基因的PCR扩增所有分子生物学试剂除特别注明外均购自大连宝生物工程有限公司。根据GenBank注册的两种β内酰胺酶全基因序列设计L1酶PCR引物(注册号X75074) 扩增873bp

的编码序列。 L2酶PCR引物(注册号Y08562) 扩增长度为905bp。引物由上海生工生物公司合成。 L1F 5

′ ATGCGTTCTACCCTGCTCGCCTTCGCC 3 ′ L1R  5 ′TCAGCGGGCCCCGGCCGTTTCCTTGGCCAG3 ′ L2F  5 ′CGATTCCTGCAGTTCAGT3′ L2R 5′ CGGTTACCTCATCCGATC3′ PCR反应条件反应体积为50μl含10×LA缓冲液5μl MgCl 2 5μl dNTP各8μlLA DNA聚合酶25U基因组DNA模板10μl引物(20μmo l/L) 1μl双蒸水195μl。扩增L 1的条件为 94℃预变性4m i n然后94℃1min 68℃1min 72℃ 1min共30个循环最后72℃延伸5min。扩增L2的条件为 94℃预变性5min然后94℃30s 55℃30s 72℃50s共30个循环最后72℃延伸7mi n。制备10%琼脂糖凝胶 PCR产物在1×TAE电泳缓冲液中电泳溴化乙啶染色用紫外透视仪观察结果收集图像。

1.5 PCR产物的纯化、克隆及测序PCR产物电泳后切胶回收纯化目的条带然后将目的基因与pMD 18T载体连接连接反应液转化至经氯化钙制备的大肠埃希菌DH5α感受态细胞中经含氨苄西林(100μg/m l)的LB培养基进行蓝白斑筛选挑取白色菌落涂布平板 37℃过夜孵育次日经PCR法筛选阳性菌落并接种在LB培养基中振摇

1618h提取质粒。以重组质粒为模板pMD 18T载体的通用引物(M13)为引物由上海华诺生物科技公司用ABI PRISM 377 DNA测序仪进行双向测序测序结果在GenBank中进行序列比对分析。

1.6L1、 L2编码基因的定位13株嗜麦芽寡养单胞菌质粒电泳后回收不同大小的质粒DNA片断再分别作为模板以L1、 L2引物进行PCR扩增(反应体系及扩增条件同前) 对两种酶基因进行定位。

1.7 序列 比对和 分子进化树构建应用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)对测序结果进行检索并比对应用Clustal W(http://www.biosoft.net)分别构建两种酶的分子进化树进化树的核苷酸序列有L1a X75074 L1b AF010282L1c AJ251814 L1d AJ251815 L1e AJ277109 ULA511L1 AJ291672L2a Y08562 L2b AJ251816 L2c AJ251817 L2d AJ272110 ULA511L2AF299368 以及临床分离菌的测定序列。

2结果

2. 1药敏实验结果表1提示所有菌株对亚胺培南耐药对复方磺胺甲口恶唑和左氧氟沙星敏感性较高在半数以上对头表1临床分离13株嗜麦芽寡养单胞菌的部分临床特点及药敏结果年龄

2.2质粒谱分析除1株外均发现约12kb左右的质粒其中2株有接近2kb的质粒条带另外一株在12kb以上还有2条带。图1示提取的质粒经琼脂糖凝胶电泳后的情况。

2.3 PCR扩增和基因克隆结果以细菌染色体DNA为模板扩增L1、L2基因的结果显示L2基因均为阳性(905bp) L1基因有2株为阴性11株菌为阳性(873bp) (图2) 。

2.4重组质粒的构建和PCR鉴定结果将L1、 L2基因的扩增产物分别连接到pMD 18T载体后转入DH5α感受态细胞中经PCR鉴定重组质粒产生的片段分别为873和905bp符合L1、 L2基因的扩增片断大小。

2.5测序结果对PCR扩增L1基因阳性的11株菌随机选取9株进行测序其结果经GenBank网上同源性比较 L1基因序列未见完全一致者。其中 1株(4号菌)与ULA511(注册号Aj 291672)的序列有2个氨基酸的改变 同源性最高为993%(在第3位由苯丙氨酸→丝氨酸第284位由精氨酸→赖氨酸) 与Avison 2分类的L1b的同源性为99%(在289位由苏氨酸→丙氨酸) 另外1株(10号菌)与L1d的同源性为921%,有23个氨基酸的改变其他菌株与L1c均有较高同源性。对PCR扩增L2基因阳性的13株菌随机选取3株进行测序 L2基因的序列有1株(2号菌)与L2b氨基酸同源性为100%与ULA 511菌株的L2基因(注册号AF299368)同源性997%。 图3分别显示两类酶的同源关系及系统进化树。 2.6 L1、 L2基因的定位分别以不同大小的质粒为模板 以L1、 L2引物进行PCR扩增结果12kb的质粒扩增到阳性

精品片断分别为873和905bp(图4) 。

2.7L1、L2基因的进化应用ClustalW构建的分子进化树如图3。进化树可直观的表示各种酶的进化关系树枝长度反映进化图2以染色体为模板扩增L1、 L2基因的电泳图距离或同源性。图3a表明除4、10号菌的L1基因外多数临床分离菌的L1酶基因与L1c同源性高从进化距离看出它们从共同祖先分歧时间相近。图3b表明所测序的3株菌与L2b和ULA511的同源性高而所有菌株与L2 d的同源性均低。

3讨论在Zhang 3、 Denny 4等报道中嗜麦芽寡养单胞菌对多种抗菌药物以及一些消毒剂表现出耐药性其机制可能与产生水解酶、渗透屏障、外排系统以及变异迅速等有关。 以往认为两种β内酰胺酶的产生是嗜麦芽寡养单胞菌对碳青霉烯类和β内酰胺类耐药的主要原因而本研究的13株菌药敏结果显示所有菌株对亚胺培南耐药但PCR扩增L1酶基因发现有2株菌a L1 b L2PCR扩增结果为阴性说明产生L1水解酶并不是碳青霉烯类耐药的惟一因素。另外13株菌的临床资料表明绝大多数患者年龄在60岁以上有些甚至为高龄或有严重基础疾病者多数患者近期使用过β内酰胺类抗生素1周以上提示高龄、体弱、免疫力低下以及有严重基础疾病或长期使用β内酰胺类抗生素为该菌感染的易感因素。细菌质粒DNA电泳发现 12株菌携带12kb大小的质粒 L1、 L2基因位于该质粒上与文献报道的L1、 L2基因位于200kb质粒上不同2。位于质粒上的耐药基因可发生横向传播导致感染的暴发流行给抗感染治疗造成极大威