土壤草根seo

Tween80作用下芘降解细菌Pyr9在三叶草中的定殖及效能陈志高,顾玉骏,张海丽,刘娟,高彦征引用本文:陈志高,顾玉骏,张海丽,等.
Tween80作用下芘降解细菌Pyr9在三叶草中的定殖及效能[J].
农业环境科学学报,2020,39(8):1748-1756.
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11654/jaes.
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11654/jaes.
2016.
06.
010关注微信公众号,获得更多资讯信息EffectsofTween80oncolonizationandperformanceofpyrene-degradingstrainPyr9inTrifoliumrepensL.
CHENZhi-gao,GUYu-jun,ZHANGHai-li,LIUJuan*,GAOYan-zheng(CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)Abstract:ToinvestigatethecolonizationandperformanceofPAH-degradingbacteriuminplantsundernonionicsurfactants,aseriesofgreenhousecontainerexperimentswereperformedwithTween80,pyrene-degradingbacteriumPyr9,andwhiteclover(TrifoliumrepensL.
)astestsubjects.
TheresultsshowedthatthecellcountsofPyr9colonizedinwhitecloverincreasedinitiallyandlaterdecreasedwiththeincreaseinTween80content.
MaximumcountwasobservedwhenthecontentofTween80was100mg·kg-1.
AhighcontentofTween80(≥500mg·kg-1)significantlyinhibitedthegrowthofwhiteclover,buttheinhibitionwasweakenedbyPyr9colonization.
TheadditionofTween80enhancedthepyreneuptakeofwhitecloverfromsoil,whiletheinoculationofPyr9significantlyreducedthepyrenecontentinwhiteclover.
Furthermore,Tween80enhancedtheremovalefficiencyofpyrenefromsoilunderthecombinationofwhitecloverandPyr9.
ProperdosageofTween80promotedthecolonizationandperformanceofpyrene-degradingstrainPyr9inwhitecloverandenhancedtheremovalefficiencyofpyreneinsoilandplants.
TheresultsnotonlyprovideatheoreticalbasisforthesafeproductionofagriculturalproductsinPAH-contaminatedareas,butalsoprovidetechnicalsupportforthe"productionwhileremediation"ofPAH-contaminatedsoil.
Keywords:polycyclicaromatichydrocarbon;Tween80;pyrene-degradingbacterium;colonization;plantuptake2020,39(8):1748-17562020年8月农业环境科学学报JournalofAgroEnvironmentScience陈志高,顾玉骏,张海丽,等.
Tween80作用下芘降解细菌Pyr9在三叶草中的定殖及效能[J].
农业环境科学学报,2020,39(8):1748-1756.
CHENZhi-gao,GUYu-jun,ZHANGHai-li,etal.
EffectsofTween80oncolonizationandperformanceofpyrene-degradingstrainPyr9inTrifoliumrepensL.
[J].
JournalofAgro-EnvironmentScience,2020,39(8):1748-1756.
Tween80作用下芘降解细菌Pyr9在三叶草中的定殖及效能陈志高,顾玉骏,张海丽,刘娟*,高彦征(南京农业大学资源与环境科学学院,南京210095)收稿日期:2020-03-14录用日期:2020-04-26作者简介:陈志高(1991—),男,硕士研究生,主要研究方向为有机污染控制与修复技术.
E-mail:2016103043@njau.
edu.
cn*通信作者:刘娟E-mail:liujuan@njau.
edu.
cn基金项目:国家自然科学基金项目(31770549,41771523)Projectsupported:TheNationalNaturalScienceFoundationofChina(31770549,41771523)摘要:为明确非离子型表面活性剂作用下多环芳烃(PAHs)降解细菌在植物中的定殖和效能,以Tween80、芘降解细菌Mycobacteriumsp.
Pyr9和三叶草作为供试对象,通过温室土培试验,探讨不同含量的Tween80对菌株Pyr9在三叶草中定殖、分布和效能的影响.
结果表明:三叶草中菌株Pyr9的数量随着Tween80含量的增加呈先升后降的趋势,Tween80含量为100mg·kg-1时其数量最高.
高剂量Tween80(≥500mg·kg-1)显著抑制了三叶草的生长,但Pyr9的定殖有效减弱了该抑制作用.
添加不同剂量的Tween80皆可促进三叶草对芘的吸收,而Pyr9的定殖可显著降低三叶草中的芘含量.
此外,添加Tween80可在一定程度上增强三叶草和Pyr9联合作用下土壤中芘的去除效率.
研究表明,适当剂量Tween80的施用有效促进了菌株Pyr9在三叶草中的定殖和效能,并增强了土壤和植物中芘的去除效率.
关键词:多环芳烃;Tween80;芘降解细菌;定殖;植物吸收中图分类号:X172;X53文献标志码:A文章编号:1672-2043(2020)08-1748-09doi:10.
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2020-0282开放科学OSID陈志高,等:Tween80作用下芘降解细菌Pyr9在三叶草中的定殖及效能2020年8月多环芳烃(Polycyclicaromatichydrocarbon,PAHs)是环境中广泛存在的一类持久性有毒有害有机污染物,主要由煤、石油、木材、有机高分子化合物等有机物在不完全燃烧或高温(>700℃)处理条件下产生[1-2].
2014年《全国土壤污染状况调查公报》指出,我国土壤PAHs总超标率为1.
4%,说明我国土壤存在一定的PAHs污染.
PAHs的强疏水性和脂溶性导致其容易吸附在土壤等固体颗粒物表面[3-4].
进入土壤中的PAHs易被植物吸收积累,并可通过食物链传递和富集,从而对生态环境和人体健康造成一定的危害[5].
调控植物对土壤中PAHs的吸收作用,进而减低作物PAHs污染风险,对于在PAHs污染区生产安全的农产品意义重大.
研究发现,一些表面活性剂对PAHs有增溶作用,可用于调控植物对PAHs的吸收和积累.
Gao等[6]研究显示,添加适量浓度的月桂醇聚氧乙烯醚(Brij35)(≤74mg·L-1)可提高菲和芘的溶解度,促进植物对菲和芘的吸收;而高浓度的Brij35(≥148mg·L-1)可与菲和芘产生竞争,并对植物有一定的毒害作用,抑制植物的吸收.
Liao等[7]研究指出,向土壤中添加适量表面活性剂可以增加PAHs的解吸率,提高PAHs的生物可利用性,并促进玉米对PAHs的吸收积累.
此外,表面活性剂还可以强化微生物-植物联合作用对土壤中PAHs的去除.
研究表明,添加生物表面活性剂鼠李糖脂和大豆卵磷脂,不仅可以显著提高根际土壤中微生物数量和总石油烃的生物可利用性,还促进了植物根系对总石油烃的吸收积累和微生物降解[8].
Ni等[9]的研究也表明,与不添加表面活性剂相比,添加表面活性剂Tween80提高了植物与微生物联合作用对土壤中菲和芘的去除率,分别提高了49.
8%和48.
1%.
除表面活性剂外,在植物根际或体内定殖功能微生物,也可有效控制植物对PAHs的吸收和积累[10-11].
Sun等[12]从生长于PAHs污染区的健康植物体内分离出一株芘降解内生细菌Staphylococcussp.
BJ06,该菌能良好定殖于植物根际、根内和茎叶内,并可以促进植物生长和芘的代谢;相比不接菌植物,接菌植物根部和茎叶部芘的含量分别降低了31.
01%和44.
22%.
Lenoir等[13]研究表明,丛枝菌根真菌(Arbuscularmycorrhizalfungi,AMF)在植物根部形成的菌根可以促进植物生长及其对根际PAHs等持久性有机污染物的吸收和去除;此外,AMF还可引起植物根系分泌物浓度和成分的改变,吸引根际微生物在植物根表大量聚集,其中不乏PAHs降解菌[14].
另外,有些AMF自身含有过氧化物酶等酶系[15],可直接降解PAHs等有机污染物.
然而,有关表面活性剂对降解细菌在植物体内定殖和分布的影响知之甚少,有关表面活性剂作用下降解细菌的定殖对植物吸收积累PAHs的影响也尚不可知.
基于此,本研究拟以非离子型表面活性剂Tween80、芘降解细菌Pyr9和三叶草作为供试对象,采用温室土培实验,研究不同剂量Tween80作用下Pyr9在三叶草根际和体内的定殖与分布情况,并探讨Tween80作用下Pyr9的定殖对三叶草吸收芘的影响.
研究结果有望初步阐明表面活性剂作用下植物来源的降解细菌在植物中的定殖和效能,为在PAHs污染区生产安全的农产品提供理论依据,也为PAHs污染土壤的"边修复边生产"提供技术参考.
1材料与方法1.
1供试材料菌株:芘降解细菌Mycobacteriumsp.
Pyr9,属环境分枝杆菌,具有氨苄青霉素和氯霉素抗性,分离于PAHs污染区植物牛筋草[Eleusineindica(L.
)Gaertn.
]根表,保存于本实验室-70℃冰箱.
植物:三叶草,品种为白车轴草(TrifoliumrepensL.
),其种子购自江苏农科种业研究院有限公司.
芘(Pyrene,纯度≥98%)购自德国Fluka公司,其相对分子量为202.
26,25℃纯水中溶解度为0.
12mg·L-1,辛醇-水分配系数(logKow)为5.
18,其溶液以丙酮为溶剂配制;甲醇、乙腈和丙酮为色谱纯,购自南京化学试剂股份有限公司;聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油脂肪酸(Tween80),购自国药集团;其他试剂均为分析纯,购自国药集团.
LB培养基:酵母膏5g·L-1,蛋白胨10g·L-1,NaCl10g·L-1,蒸馏水1000mL,pH7.
0.
无机盐培养基(MSM):(NH4)2SO41.
50g·L-1,K2HPO4·3H2O1.
91g·L-1,NaCl0.
5g·L-1,KH2PO40.
50g·L-1,MgSO4·7H2O0.
20g·L-1,微量元素溶液2mL,蒸馏水1000mL,pH7.
0~7.
2.
微量元素溶液:CoCl2·6H2O0.
1g·L-1,MnCl2·4H2O0.
425g·L-1,ZnCl20.
05g·L-1,NiCl2·6H2O0.
01g·L-1,CuSO4·5H2O0.
015g·L-1,Na2MoO4·2H2O0.
01g·L-1,Na2SeO4·2H2O0.
01g·L-1.
芘降解培养基(PMM):2g·L-1的芘丙酮溶液过0.
22μm滤膜除菌,取一定量置于灭菌的三角瓶中,待丙酮挥发完全后加入灭菌的MSM,使芘的最终浓度达到50mg·L-1.
若制备固体1749农业环境科学学报第39卷第8期培养基,则向上述液体培养基中加入18g·L-1的琼脂.
灭菌条件:温度121℃,时间20min.
1.
2细菌Pyr9以芘为碳源的生长与降解曲线测定向无菌的50mL玻璃三角瓶中加入一定量芘丙酮母液,待丙酮挥发后加入灭菌的20mL无机盐溶液,使芘的浓度为50mg·L-1(丙酮含量<0.
5%),再以2%的接种量加入菌株Pyr9的新鲜菌悬液(OD600nm=1.
0,对照组加等量灭活菌悬液);处理组和对照组皆设置8个取样时间点,每个时间点3个重复,共48个三角瓶,于30℃、180r·min-1条件下摇床恒温培养,培养时间为14d;期间每2d同一时间取出每组设置的3个三角瓶,加入2倍体积的甲醇,超声30min后静置2h,取适量溶液过0.
22μm孔径的有机相滤膜,装于液相瓶中,保存于-20℃冰箱,待测定[12].
同时,在加入甲醇之前,将摇瓶中培养基摇匀后取0.
5mL培养液,采用梯度稀释涂布平板法进行菌落计数[12],并以此计算培养液中细菌Pyr9的数量.
培养液中芘的含量用岛津LC-20AT高效液相色谱仪(HPLC)测定[16],其检测条件为:色谱柱为Φ4.
6mm*250mm烷基C18反相柱;流动相为甲醇/水(V∶V=90∶10),流速1mL·min-1;柱温40℃;进样量20μL;检测时间8min;检测波长254nm.
1.
3供试土壤的采集和处理供试土壤取自南京某农田表层土壤(0~20cm),类型为黄棕壤,其中PAHs未检出.
土壤pH6.
03,有机碳含量14.
3g·kg-1.
土样采集后,风干,过10目筛;取少量风干土壤添加适量含芘的丙酮溶液,充分混合均匀;待丙酮完全挥发后,将含芘的风干土壤与剩余风干土壤充分混合均匀.
其中芘的添加量参考研究组之前调查的长三角地区石化厂周边PAHs重污染区表层土壤中的实际PAHs总含量.
称取300g上述土样于盆钵中,在50%田间持水量下平衡老化60d后待用.
测得土壤中芘的初始含量为7.
86mg·kg-1.
1.
4盆栽实验设置三叶草种子经10%双氧水浸泡消毒5min后立即用无菌水冲洗[17],在蛭石中催芽至10cm后移栽至污染土壤中,每盆留苗12株.
实验设置4个处理:空白对照组(CK),污染土壤;种植植物组(CP),污染土壤+三叶草;接菌组(CB),污染土壤+Pyr9;灌根组(CPR),污染土壤+三叶草+Pyr9灌根.
CPR是于移栽后取10mLPyr9菌悬液(OD600nm=1.
0)均匀灌溉于三叶草根部,CP以灭活的菌液做相同处理,CB为同时取10mL菌悬液均匀灌溉于土壤中.
移栽植物3d后向各处理土壤中施入不同浓度的Tween80溶液,其终浓度设置为:0、100、250、500、1000mg·kg-1干土.
每个处理设置3组重复.
试验期间设定温度为白天25℃,夜晚20℃.
植物生长过程中定期浇水,每2d随机交换盆钵的位置.
为了及时检测细菌Pyr9在土壤-三叶草中的分布,灌根处理10d后即采集土壤和三叶草样品,检测其中的芘含量和Pyr9数量.
1.
5三叶草生物量的测定收集培育好的新鲜植物样,用灭菌毛刷轻轻擦去根部土壤,再用无菌水冲洗植株至少3min,将植株根系和茎叶表面附着物全部冲洗干净后,用吸水纸吸干植株表面水分.
将三叶草根和茎叶分开,用万分之一分析天平分别称量其鲜质量,并记录数据.
1.
6根际土壤和三叶草中功能细菌Pyr9的数量测定菌株Pyr9具有氨苄青霉素和氯霉素抗性,且在芘降解平板上可形成降解圈,以这些特征作为标记对定殖在土壤和植物中的菌株Pyr9进行计数.
取5.
0g根际土壤,置于装有45mL无菌水的三角瓶中,内置玻璃珠数颗,于摇床220r·min-1振荡10min后,立即吸取土壤悬液梯度稀释并涂布于含有氨苄青霉素(75mg·L-1)和氯霉素(25mg·L-1)的芘降解固体培养基上,30℃恒温培养7d,于紫外灯下观察菌株Pyr9生成的降解圈,并对菌株Pyr9进行计数,以计算每克土壤中的细菌Pyr9数量.
为防止将其他细菌计入其中,随机挑取平板上生成降解圈的菌株进行16SrRNA基因的PCR扩增和测序[10],确定其为细菌Pyr9.
三叶草生物量测定后,将其根和茎叶分开,分别取适量样品置于无菌研钵中,添加无菌水研磨成悬液,按上述方法对定殖于三叶草中的菌株Pyr9进行计数.
1.
7土壤和三叶草中芘含量的测定1.
7.
1土壤中芘含量的测定取一定量冷冻干燥后的土样置于研钵中,充分磨碎后过20目筛,取2g上述土样于玻璃离心管中,加入10mL体积比为1∶1的二氯甲烷与正己烷的混合液,盖紧盖子后超声萃取1h,以4000r·min-1的速度离心10min,再取5mL上清液过2g-2g无水硫酸钠-硅胶柱,并用10mL体积比为1∶1的二氯甲烷和正己烷溶液洗脱,将洗脱液收集至旋转蒸发瓶,40℃恒温下浓缩至干,用甲醇定容到2mL,过0.
22μm孔径滤膜后,用HPLC/UV检测分析[18].
1.
7.
2三叶草中芘含量的测定将植物的根和茎叶用剪刀剪断,分装于自封袋1750陈志高,等:Tween80作用下芘降解细菌Pyr9在三叶草中的定殖及效能2020年8月中,置于冷冻干燥机中冷冻干燥2~3d,将冷冻干燥后的植物根和茎叶用研钵充分研磨粉碎,然后称取一定量植物样于30mL玻璃离心管中,再加入10mL二氯甲烷和正己烷(V∶V=1∶1)的混合溶液超声萃取30min,重复3次[19].
按照1.
7.
1的方法进行三叶草中芘含量测定.
1.
8芘在三叶草中的富集和转移系数计算三叶草中芘富集系数(Plantconcentrationfactor,PCF)的计算方式为[12]:PCF=Cp/Cs式中:Cp表示三叶草中芘的含量,mg·kg-1;Cs表示土壤中芘的含量,mg·kg-1.
三叶草中芘转移系数(Translocationfactor,TF)的计算方式为[12]:TF=SCF/RCF式中:SCF表示芘在三叶草茎叶中的富集系数;RCF表示芘在三叶草根中的富集系数.
2结果与分析2.
1以芘为碳源的细菌Pyr9生长曲线与芘降解曲线菌株Pyr9的生长和芘降解曲线如图1所示,经过2d的适应期后,菌株Pyr9进入快速代谢芘的阶段,同时菌株数量快速增加.
当培养至第10d时,菌株Pyr9对芘的降解率已在95%以上,同时菌株到达稳定期;而相同时间内添加了等量灭活菌株的对照组中芘浓度因非生物因素仅降低了8.
64%,这表明细菌Pyr9对芘有良好的降解能力.
在10~12d时,残留的芘进一步被代谢完全,菌株Pyr9则停止增殖,其数量略有下降.
2.
2不同添加量Tween80作用下细菌Pyr9在土壤和三叶草中的定殖和分布不同添加量Tween80作用下菌株Pyr9在土壤和三叶草中的数量变化如表1所示.
当Tween80添加量在100~500mg·kg-1范围时,CB组和CPR组土壤中Pyr9的数量皆略高于未添加Tween80处理;而当Tween80添加量为1000mg·kg-1时,CB组土壤中Pyr9的数量有所下降.
随着Tween80添加量的增长,定殖在三叶草根部和茎叶部的Pyr9数量也呈现先增后减的趋势,其中100mg·kg-1的Tween80最有利于菌株Pyr9的定殖和生长.
与土壤中类似,当Tween80添加量为1000mg·kg-1时,定殖在三叶草体根部和茎叶部的Pyr9数量开始下降.
2.
3不同剂量Tween80的添加和细菌Pyr9的定殖对三叶草生长的影响不同剂量Tween80的添加和细菌Pyr9的定殖对三叶草根部和茎叶部生物量(鲜质量)的影响如图2所示.
在供试Tween80剂量范围内,CP组和CPR组三叶草根部和茎叶部的生物量随Tween80含量的增加呈逐渐减少的趋势.
如当Tween80添加量为1000mg·kg-1时,CP组三叶草根部和茎叶部的生物量(455mg和1353mg)较不添加Tween80对照组三叶草根部和茎叶部的生物量(583mg和1607mg)分别减少了22%和16%.
菌株Pyr9的定殖在不同Tween80添加剂量下均可显著提高三叶草的生物量(P<0.
05).
如当Tween80含量为500mg·kg-1时,CPR组三叶草根部的生物量(632mg)比CP组(503mg)提高了图1以芘为碳源的芘降解曲线和菌株Pyr9生长曲线Figure1Thepyrene-degradingandPyr9growthcurveofstrainPyr9withpyreneasthecarbonsource芘浓度Pyreneconcentration/(mg·L-1)0369时间Time/d6050403020100Pyr9数量CellcountofPyr9/(logCFU·mL-1)8.
28.
07.
87.
67.
47.
27.
06.
81215对照组芘浓度Controlcheckofpyreneconcentration芘浓度PyreneconcentrationPyr9数量CellcountofPyr9注:CB,污染土壤+Pyr9;CPR,污染土壤+三叶草+Pyr9灌根;FW,鲜质量.
"±"后数据为标准差(n=3);表中同列不同小写字母表示差异达到显著水平(P<0.
05).
Note:CB,inoculatedwithstrainPyr9incontaminatedsoil;CPR:plantedwhitecloverandinoculatedwithstrainPyr9viarootirrigatingincontaminatedsoil;FW,freshweight.
Dataafter"±"arestandarddeviations(n=3).
ThedifferentlowercaselettersinacolumnindicatesignificantdifferencesamongtreatmentsatP<0.
05levels.
表1土壤和三叶草中定殖的菌株Pyr9数量(logCFU·g-1FW)Table1ThecellcountsofstrainPyr9colonizedinsoilandwhiteclover(logCFU·g-1FW)Tween80/(mg·kg-1)01002505001000土壤SoilCB4.
30±0.
10ab4.
42±0.
11a4.
48±0.
12a4.
43±0.
08a4.
23±0.
08bCPR4.
56±0.
20b4.
60±0.
12ab4.
68±0.
18ab4.
85±0.
07a4.
57±0.
03b三叶草Whiteclover茎叶部Shoot3.
98±0.
10b4.
23±0.
13a4.
08±0.
12ab4.
03±0.
13ab3.
68±0.
11c根部Root4.
82±0.
13ab5.
04±0.
12a4.
88±0.
13ab4.
84±0.
13ab4.
66±0.
04b1751农业环境科学学报第39卷第8期26%,而茎叶部生物量(1719mg)则比CP组(1424mg)提高了21%.
2.
4不同剂量Tween80的添加和细菌Pyr9的定殖对三叶草吸收积累芘的影响不同剂量Tween80的添加和细菌Pyr9的定殖对三叶草根部和茎叶部吸收积累芘的影响如图3所示.
随着Tween80添加量的增加,三叶草根部和茎叶部的芘含量整体呈上升趋势.
Tween80含量在0~250mg·kg-1时,三叶草中的芘含量上升迅速,Tween80含量在250~1000mg·kg-1时,其上升相对平缓.
不添加Tween80时,CP组三叶草根部和茎叶部的芘含量分别为1.
99mg·kg-1和0.
84mg·kg-1,而添加250mg·kg-1Tween80时其根部和茎叶部的芘含量分别为2.
52mg·kg-1和1.
13mg·kg-1,与不添加Tween80对照组相比分别提高了27%和35%;而当Tween80含量为1000mg·kg-1时,CP组三叶草根部和茎叶部的芘含量分别为2.
66mg·kg-1和1.
10mg·kg-1,与不添加Tween80对照组相比分别提高了34%和31%.
菌株Pyr9在三叶草中的定殖能显著降低三叶草体内的芘含量(P<0.
05),且添加Tween80可增强菌株Pyr9的作用效果.
当不添加Tween80时,CP组和CPR组三叶草根部芘含量分别为1.
99mg·kg-1和1.
83mg·kg-1,茎叶部芘含量分别为0.
84mg·kg-1和0.
76mg·kg-1;与CP组相比,CPR组三叶草根部和茎叶部芘含量分别降低了8.
0%和9.
5%.
在Tween80添加量为500mg·kg-1时,CP组三叶草根部和茎叶部芘含量分别为2.
44mg·kg-1和1.
16mg·kg-1,此时CPR组三叶草根部和茎叶部芘含量分别为1.
98mg·kg-1和0.
92mg·kg-1,与CP组相比分别降低了19%和21%.
以上结果表明,相较于细菌Pyr9的单独作用,添加适量CP,污染土壤+三叶草;CPR,污染土壤+三叶草+Pyr9灌根.
图中柱头不同小写字母表示差异达到显著水平(P<0.
05).
下同CP,plantedwhitecloverincontaminatedsoil;CPR:plantedwhitecloverandinoculatedwithstrainPyr9viarootirrigatingincontaminatedsoil.
ThedifferentlowercaselettersonthebarsindicatesignificantdifferencesamongtreatmentsatP<0.
05levels.
Thesamebelow图2不同Tween80添加量下三叶草的生物量Figure2ThebiomassofthewhitecloverunderdifferentTween80contents图3不同Tween80添加量下三叶草中的芘含量Figure3ThecontentsofpyreneinthewhitecloverunderdifferentTween80contents茎叶部生物量Shootbiomass/(mg·pot-1)0100250500Tween80含量Tween80content/(mg·kg-1)22002000180016001400120001000acdaadebdf根部生物量Rootbiomass/(mg·pot-1)0100250500Tween80含量Tween80content/(mg·kg-1)80070060050040001000accdaabcdebdfCPCPRCPCPR茎叶部芘含量Pyrenecontentinshoot/(mg·kg-1)0100250500Tween80含量Tween80content/(mg·kg-1)1.
41.
21.
00.
80.
601000dcdbcdbcaabcba根部芘含量Pyrenecontentinroot/(mg·kg-1)0100250500Tween80含量Tween80content/(mg·kg-1)3.
02.
52.
01.
501000fecedbceca1752陈志高,等:Tween80作用下芘降解细菌Pyr9在三叶草中的定殖及效能2020年8月Tween80和细菌Pyr9共同作用对于降低植物体内的芘含量效果更为显著(P<0.
05).
2.
5不同添加量Tween80作用下细菌Pyr9和三叶草共同作用对根际土壤中芘的去除不同添加量Tween80处理下土壤中的芘残留含量如图4所示.
从图中可以看出,在0~500mg·kg-1范围内,随着Tween80含量的增加,土壤中的芘含量呈逐渐降低的趋势.
Tween80添加量为500mg·kg-1时,CK组土壤中芘含量为2.
78mg·kg-1,而不添加Tween80的CK组为4.
28mg·kg-1,前者与后者相比土壤中的芘含量降低了35%.
相较之下,Tween80添加量为1000mg·kg-1时,CK组土壤中的芘含量(3.
54mg·kg-1)不再继续减少,反而有所增高,但仍低于不添加Tween80的CK组(4.
28mg·kg-1).
对相同剂量Tween80处理下CP组、CB组与CPR组土壤中芘的残留量进行比较发现,CPR组的芘含量要显著低于CP组和CB组(P<0.
05).
如当Tween80添加量为100mg·kg-1时,CP组、CB组和CPR组土壤中芘的残留量分别为3.
37、3.
64、2.
94mg·kg-1,CPR组比CP组和CB组分别降低了13%和19%,这表明相对于三叶草或菌株Pyr9的单独作用,三叶草和菌株Pyr9的共同作用对土壤中芘的去除效果更佳.
当Tween80添加量为500mg·kg-1时,CPR组土壤中芘的残留量为2.
17mg·kg-1,与不添加Tween80的CK组(4.
28mg·kg-1)相比降低了49%.
综上所述,添加适量Tween80有助于提高三叶草和菌株Pyr9共同作用下对土壤中芘的去除.
为了及时检测功能细菌Pyr9在根际土壤和三叶草中的分布,盆栽培养10d后即采样检测了根际土壤和三叶草体内的芘含量,此时Tween80-细菌Pyr9-三叶草共同作用对土壤中芘的去除并不彻底;若培养时间延长,该体系下的芘污染最终应该会被彻底消除.
2.
6不同剂量Tween80-细菌Pyr9共同作用下芘在三叶草中的富集和转移系数进一步计算了不同Tween80添加量下三叶草对土壤中芘的富集系数以及芘在三叶草中的转移系数,结果如表2所示.
添加不同剂量Tween80均使三叶草中芘的富集系数显著升高(P<0.
05),说明Tween80促进了三叶草对土壤中芘的富集作用,增强了其芘污染风险;而接种功能细菌Pyr9可在一定程度上降低这种风险.
随着Tween80添加量的增加,三叶草中的芘富集系数整体呈先升后降的趋势;Tween80添加量为500mg·kg-1时,三叶草根部和茎叶部的芘富集系数最高.
相较而言,芘在三叶草中的转移系数相对稳定,在Tween80添加量改变或是否接种功能菌株表2不同Tween80添加量下三叶草对土壤中芘的富集系数和转移系数Table2ThePCFandTFofpyreneinthewhitecloverunderdifferentTween80contents注:CP,污染土壤+三叶草;CPR,污染土壤+三叶草+Pyr9灌根.
"±"后数据为标准差(n=3);表中同一组系数下的不同小写字母表示差异达到显著水平(P<0.
05).
Note:CP,plantedwhitecloverincontaminatedsoil;CPR:plantedwhitecloverandinoculatedwithstrainPyr9viarootirrigatingincontaminatedsoil.
Dataafter"±"arestandarddeviations(n=3).
ThedifferentlowercaseletterswithinthesamesetoffactorsindicatesignificantdifferencesamongtreatmentsatP<0.
05levels.
项目Items根部富集系数PCF-root茎叶部富集系数PCF-shoot转移系数TF处理TreatmentsCPCPRCPCPRCPCPRTween80/(mg·kg-1)00.
53±0.
01f0.
54±0.
00f0.
22±0.
01f0.
23±0.
02f0.
42±0.
02cd0.
42±0.
03cd1000.
68±0.
02e0.
67±0.
02e0.
27±0.
00e0.
27±0.
01e0.
40±0.
01d0.
40±0.
02d2501.
00±0.
03a0.
90±0.
01b0.
45±0.
02b0.
39±0.
03c0.
45±0.
01ab0.
43±0.
02bcd5001.
02±0.
04a0.
91±0.
02b0.
49±0.
04a0.
42±0.
00bc0.
48±0.
01a0.
46±0.
01ab10000.
83±0.
03c0.
77±0.
03d0.
34±0.
02d0.
32±0.
02d0.
41±0.
03cd0.
42±0.
01cd图4不同Tween80添加量下土壤中的芘含量Figure4ThepyreneresiduesinsoilsunderdifferentTween80contentsCKCP土壤中芘含量Pyrenecontentinsoil/(mg·kg-1)0100250500Tween80含量Tween80content/(mg·kg-1)5432101000babcfhdehjjkkcdfiilkfghegCBCPR1753农业环境科学学报第39卷第8期Pyr9情况下的变化不大,说明芘从三叶草根部向茎叶部的转移受Tween80或功能细菌Pyr9的影响不大.
3讨论相比于阴离子和阳离子型表面活性剂,非离子型表面活性剂具有低毒性、易被生物降解的特点[20];Tween80作为典型的非离子型表面活性剂,被广泛应用于土壤PAHs的植物-微生物联合修复[21].
本研究发现,中低剂量的Tween80(≤500mg·kg-1)可以促进降解细菌Pyr9在土壤中的定殖和生长,而高剂量的Tween80(1000mg·kg-1)则会产生抑制作用.
这可能是由于低剂量的Tween80促进了土壤中芘的溶出[22],增加了芘的生物可利用性[23-24],进而促进了Pyr9的增殖[7];而高剂量的Tween80对Pyr9有毒害作用,抑制了其增殖[25].
定殖于三叶草中的Pyr9的数量变化规律与土壤中类似,Tween80含量为100mg·kg-1时其数量最高,在土壤中则是Tween80含量为500mg·kg-1时其数量最高.
造成这种差异的原因可能是高剂量Tween80对植物根部有损害[7],不利于菌株Pyr9从三叶草根际向体内的迁移.
此外,高剂量的Tween80(500~1000mg·kg-1)显著抑制了三叶草的生长.
推测原因,一方面是因为Tween80对植物根部细胞有毒害作用[26],剂量越高,其对植物的毒害作用越大;另一方面,高剂量Tween80促进了土壤中芘的溶出,从而增强了芘对植物的胁迫作用.
而细菌Pyr9的定殖则使三叶草的生长抑制显著减低,这是由于Pyr9本身具备的产吲哚乙酸(IAA)、产铁载体以及溶磷能力促进了三叶草的生长;同时菌株Pyr9可快速降解三叶草根际和体内的芘,缓解了高浓度芘对三叶草的生长胁迫作用.
添加适量Tween80可提高土壤中PAHs等有机污染物的溶解性和生物可利用性,使其更容易被植物吸收或被微生物降解[26-27].
在本研究中,添加不同剂量Tween80均促进了三叶草对芘的吸收,且当Tween80含量在0~250mg·kg-1时,三叶草中的芘含量随Tween80含量增加上升迅速.
此外,随着Tween80含量的增加,土壤中的芘含量先减少后增加,说明高浓度Tween80(1000mg·kg-1)不利于土壤中芘的去除.
众多研究也证实[20-21,28],添加适量的Tween80能显著提高PAHs的生物降解率;而过量添加Tween80虽可促进土壤中PAHs的解吸并提高PAHs的溶解性,但会抑制PAHs的生物降解过程.
其原因有以下三点:(1)PAHs与Tween80胶束结合,反而降低了其生物有效性[29];(2)高浓度的Tween80会破坏细菌细胞膜,导致细菌死亡[30];(3)Tween80作为碳源和能源优先被微生物利用[31].
PAHs降解细菌在根际土壤和植物中的定殖能有效减低植物体内的PAHs含量,降低其PAHs污染风险[12].
在本研究中,相比于不接种Pyr9的三叶草,接菌处理的三叶草根部和茎叶部芘含量显著降低,芘富集系数也明显下降.
研究表明,植物根际和体内存在数量可观的PAHs降解细菌,可用于植物-微生物联合作用修复PAHs污染[32-33].
在根际微生态环境中,植物根系分泌物(糖类、有机酸和氨基酸等)可为根际细菌提供营养物质,并且吸引根际细菌在植物根表定殖形成聚集体或细菌生物膜.
根际细菌则可通过产生促生物质促进植物生长,或是通过降解PAHs等有机污染物提高植物对污染环境的抗逆性[32,34].
此外,一些定殖在植物根表的PAHs降解细菌还可进入植物体内成为内生细菌,直接降解植物体内的PAHs,或是诱导植物体内的PAHs代谢酶系,加速植物体内PAHs的去除[35].
另外,功能内生细菌也可通过基因水平转移将自身的PAHs降解基因转移给其他植物内生细菌[36],以加速植物体内PAHs的降解,减少PAHs在植物组织中的积累.
目前已有的研究多是关注Tween80等表面活性剂对植物吸收代谢PAHs或微生物降解PAHs的影响,有关表面活性剂对降解细菌在植物根际和体内的定殖、分布以及效能的影响尚未见报道.
本研究通过温室土培实验,研究了0~1000mg·kg-1的Tween80作用下细菌Pyr9在三叶草根部的定殖和分布以及对三叶草吸收累积芘的影响,获得了一些初步的结果,为保障PAHs污染区农产品安全提供了理论依据.
但本研究尚有几点不足之处,在此说明,并建议作为后续研究的关注点:(1)盆栽实验所采用的PAHs为单一芘污染,而实际环境中多为多种PAHs复合污染,且浓度差异较大,在这种复杂的环境中应用该技术效果如何尚不可知;(2)为了及时追踪菌株Pyr9在三叶草中的定殖和分布,三叶草植株的整体培养时间较短,后续可开展不同培养时间的连续采样检测,以监测各个指标的动态变化;(3)不同剂量Tween80对植物根际和体内微生物群落结构以及PAHs代谢酶系活性的影响未做探讨.
完成以上几个方面的研究,方可全面深入地阐述Tween80-植物-微生物-PAHs之间的相互关系.
1754陈志高,等:Tween80作用下芘降解细菌Pyr9在三叶草中的定殖及效能2020年8月4结论(1)低剂量(100mg·kg-1)的Tween80可促进菌株Pyr9在三叶草中的定殖和生长,且对三叶草的生长影响不大.
(2)高剂量(≥500mg·kg-1)的Tween80可抑制三叶草的生长,而菌株Pyr9的定殖则可促进三叶草的生长.
(3)适当剂量Tween80(100~500mg·kg-1)的施用可有效促进菌株Pyr9降解三叶草中的芘.
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