检测空间克隆网站

国外医学输血及血液学分册2005年第28卷箍5荧光聚合酶链反应检测急性早幼粒细胞白血病PML/RAR的临床价值赵峻峰综述朱平审校【摘要】实时定量逆转录聚合酶链反应是目前最精确地检测急性白血病微小残留病的方法,对急性早幼粒细胞PML/RARa融合基因表达量的测定及动态变化监测,取得PML/RARa融合基因的表达拷贝数,对临床治疗、预防复发、延长患者生存期,最终治愈白血病具有重要的指导意义.
【关键词】急性早幼粒细胞白血病;PML/RARa融合基因;实时定量聚合酶链反应;微小残留病急性早幼粒细胞白血病(APL)是急性白血病常见类型之一,属急性髓系白血病.
目前通过全反式维甲酸(ATRA)、联合化疗、砷剂及各种造血干细胞移植等治疗,其临床完全缓解率及治疗后5年生存率居急性髓细胞白血病首位].
但是白血病复发一直是困扰临床进行缓解后巩固、维持治疗及影响患者总生存期的主要障碍,而复发的根源主要是来自体内残留白血病细胞,即急性白血病微小残留病(MRD).
目前MRD的检测主要应用聚合酶链反应(PCR)技术l_3"],扩增肿瘤特异性基因来识别体内的白血病细胞.
目前检测残留白血病细胞的灵敏度达10~10'.
.
,即能检测1万至1O万细胞中所含的一个瘤细胞].
此时若未测到代表残留病的肿瘤特异性基因,可称"分子完全缓解".
白血病细胞往往存在标志性肿瘤特异性克隆基因,主要为染色体、抗原受体、特殊基因的缺失或重排.
API则存在特异性融合基因及表达蛋白,可以成为检测MRD的特异性靶点.
本文讨论急性早幼粒细胞白血病微小残留病(APL—MRD)检测的研究进展及临床意义.
1APL的融合基因作为检测MRD的特异性靶点APL主要出现的融合基因是PML/RARa融合基因.
1990年DeThe发现API特征性改变大多数是t(15;17)(q22;q21)的PMI/RARa融合基因,其分子水平发生率达100%.
为位于染色体15q22早幼粒细胞白血病(PML)基因及染色体17q21的维甲酸受体a(RARa)基因融合,形成一个新的PML/RARa融合基因.
PML基因第15号染色体上分子断裂点主要在第6内含子(bcr1)、第6外显子(bcr2)和第3内含子(bcr3)上,在胎儿和成人组织中都有不同程度表达,因此PML蛋白可能是一转录因子.
RARa由A,B,C,D,作者单位:075000张家口,河北北方学院附属第一医院(赵峻峰);100034北京大学第一医院血液内科(朱平)·391··综述·E,F等6个功能区构成,其中A/B为转录调节区,c为DNA结合区,E为配体结合区.
RARa是细胞内受体,该受体控制粒细胞的终末分化.
PML/RARa融合基因阻碍粒细胞的分化,高浓度的维甲酸使融合受体激活,解除抑制状态,表现为诱导分化.
因此ATRA治疗此型有效l_6·.
PML/RARa会产生长度不同的两种融合基因,相差3个外显子,即PML第6外显子和RARa第3外显子形成L型和PML第3外显子和RARa第3外显子形成S型.
APL还存在其他融合基因,如PLzF/RARa融合基因,即染色体1lq23和17q21易位形成的早幼粒细胞锌指(promyelocyticleukemiazinc—finger,PLZF)基因和RARa基因融合.
NPM/RARa融合基因,即染色体5q35与17q21易位形成的.
NUMA/RARa融合基因,染色体1lq13和17q21易位形成.
STAT5B/RARa融合基因,染色体17ql1内问质缺失形成.
这些融合基因为检测APL的肿瘤特异性分子标志].
2PCR检测MDR利用肿瘤特异性基因作为分子靶(moleculartarget)[gdo],PCR扩增特异性序列检测残留白血病细胞的灵敏度可达10-5~10'.
.
.
最早针对APL/MRD检测的报告见于1993年.
陈赛娟等妇利用RT—PCR对完全缓解的APL患者检测PML/RARa融合基因表达,以预测分子复发,研究表明PML/RARa融合基因消失后,如果再次出现就与APL复发有关.
可以用于监测白血病分子水平复发,及早采取干预措施使患者达到二次分子缓解;指导临床的巩固、维持治疗,减少治疗的盲目性,延长生存期.
常规RT—PCR的检测是PCR后行琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺电泳,根据DNAMarker估计产物分子量,用阳性及阴性对照判断产物是否为特异性PCR产物条带,或测序确认产物是否为目的融合基因序列.
此方法简便易行,价格相对低廉,http://www.
paper.
edu.
cn灵敏度较高.
但本身有局限性:①由于早幼粒细胞较脆弱,易激活凝血酶系统,增强APL骨髓RNA酶活性,致使提取RNA时容易降解,用此法检测APL/MRD可靠性有疑问;②实验室行RT—PCR时容易造成污染,导致假阳性结果,影响病情判断;③需时间较长,尤其聚丙烯酰胺电泳步骤烦琐;④判断产物时不能定量,因而无法作出客观评价.
巢式PCR敏感性高,可以用竞争或内源性参比法作基因半定量.
但是这种定量法属于PCR终点检测法,不同循环次数和达到平台期的时间不同可致使产量相差很大,很难准确定量,耗时长,重复性差,定量标准不统一.
3实时荧光定量PeR的方法学实时荧光定量RT—PCR(real—timequantitativereverse—transcriptasepolymerasechainreaction,Q—PCR)检测方法,是最近出现的精确基因定量技术,使患者在不同时间、不同地点进行检测的结果有可比性.
2001年Gabert教授在法国举行的EAC(EuropeAgainstCancer)会议上报告了应用荧光定量PCR检测系统可以对样本进行精确而完善的定量测定.
其常用的检测模式有以下四种.
3.
1SYBRGreen1染料法SYBRGreen1是一种与双链DNA小沟结合的染料,结合后信号增强,在PCR循环连续进行中,双链DNA产物不断增加与染料结合并释放荧光信号.
因此在一个体系内信号强度代表双链DNA分子的数量,所产生的与非特异性双链DNA(如引物二聚体)结合的干扰可通过熔解曲线分析得到解决.
SYBRGreen1只要有合适的引物和模板即可实现任何目的基因实时定量,且价格便宜.
3.
2TaqMan探针法利用Taq酶的5一3外切核酸酶活性在PCR过程中,反应体系加入一个荧光标记探针.
据3端标记的荧光猝灭基团分常规TaqMan探针和TaqManMGB探针,常规TaqMan探针的5端标以荧光发射基团FAM(6-carboxyfluorescein,6一羧基荧光素),3端标以荧光猝灭基团TAMRA(6-carboxy—tetramethyl—rhodamine,6-羧基四甲基若丹明).
该探针在PCR过程中不被延伸,PCR循环连续进行FAM远离TAMRA,释放荧光信号,模板每复制一次,便释放一个信号,可对模板进行准确定量.
TaqManMGB探针3端另结合了MGB(minorgroovebinder)结合物,使探针Tm值提高,增加了探针杂交的稳定性和提高了其分辨率.
.
3.
3杂交探针法国外医学输皿及姐液学分册2005年第28卷第5期即应用两个序列特异性的探针,一个在3端标记荧光供体(如FAM),与另一个在5端标记荧光受体(如LCRED640、LCRED705)相交叠.
在PCR变性或延伸初期两个探针处于分离、游离状态,距离较远,不能产生能量转移发出荧光.
PCR变性后或退火阶段两探针与扩增产物杂交,并形成头尾结合形式,即3端标记荧光供体与5端标记荧光受体紧密连接(相距仅lbp).
波长较长的荧光供体激活荧光受体,产生荧光共振能量转移,发出荧光信号,伴随PCR过程模板的增加,则可检测的荧光信号强度增强.
只有当两种探针都与扩增物序列杂交时,才能记录长波长信号,这样便增加了杂交探针的特异性.
3.
4分子信标法为环状结构探针,包含特异性的寡核苷酸序列,其末端形成的颈状结构包含相互贴近的荧光染料和荧光猝灭剂,因能量转移,不产生荧光信号.
杂交到CDNA或DNA靶序列时,荧光染料和荧光猝灭剂分离,释放荧光信号.
Q—PCR较常规PCR具有明显优势,首先操作简便、快速、高效,具有很高的敏感性、特异性;其次在密闭体系中完成扩增并进行实时测定,降低了污染可能性;另外,可使用不同引物和颜色的荧光探针在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增,即多萤Q—PCREla,14].
4其他可以用于APL—MRD检测的技术APL—MRD检测还可以应用常规细胞遗传学技术,诊断时确定染色体异常来检测MRD,但是染色体分析时要求分析的核型数量很少,通常为30个,假阴性比例高.
荧光原位杂交可以分析较多的细胞,通常用荧光素标记染色体特异性探针与间期细胞核DNA原位杂交识别染色体数目和结构异常.
但是往往假阳性可以达到3左右,不适用于MDR诊断.
有人采用多参数流式细胞仪(flowcytometry)诊断MDR,适当的白细胞免疫标记组合起来检测MDR细胞,其敏感性达10以上,仍然低于RT—PcR.
用免疫组化法检查t(15;17)APL细胞显示了抗PML标记抗体有独特的异常分布.
正常细胞中PML蛋白以点状方式分布于细胞核,属于被称为核体或PoDS(PMLoncogenicdomains)的核内亚微结构.
免疫组化法标记的抗PML抗体分布在5~20个散在的PoDS区;而APL细胞中PML/RARa二聚体破坏了正常的PoDS结构,使PMI蛋白呈异常小的多颗粒方式镰状分布于核周细胞浆中,因此APL患者标记的抗PML抗体分布在镰变区,经治疗缓解后PoDs结构恢复正常.
已有报道,单克隆抗体(MoAb)PG—M3是检测APLPML/国外医学输血及血液学分册2005年第28卷第5期RARa融合蛋白最有特异性的抗体.
此法结果符合率接近Q—PCR,但敏感性低于Q—PCR.
5实时荧光定量PeR技术用于APLMRD检测的临床研究APL缓解后的治疗目的是消灭体内MRD,减少复发,延长生存期.
白血病患者骨髓存在正常的多克隆造血和白血病单克隆造血两类竞争性细胞群,缓解后正常造血细胞远远多于白血病细胞,临床一般对患者进行2~3年的维持化疗,以避免复发.
大剂量化疗不仅杀伤了残留白血病细胞,同时也杀伤了大量的正常造血细胞,可以出现骨髓抑制,感染,血小板下降及医源性疾病.
采用可靠的API一MRD检测技术检测可以有效监测APL的复发,减少维持化疗的盲目性l_】.
对初治APLPMI/RARe融合基因转阴过程的基因拷贝数的检测有益于确定进一步诊疗方向.
Grimwade等n研究t(15,17)(q22;q21)在检测MRD意义时采用了RT—PCR检测融合基因,但提出Q—PCR可能提供融合基因转录本量以预测MRD,指导临床.
Gallgher等叩探讨了Q—PCR法检测APLPML/RARamRNA的临床意义.
ATRA诱导并联合化疗(两个疗程DA方案)治疗后的123份样本经Q—PCR检测PML/RARa融合基因,他们提出只有样本拷贝数大于管家基因GAPDHITIRNA2.
5*10j时,才表明此样本检测有效.
实验数据显示荧光定量RT—PCR方法的敏感度达到10_.
.
,可以有效预测复发风险.
其73患者的样本测定值低于10~,且1010-6复发风险高于10以下.
因此研究认为Q—PCR敏感性较高(敏感性超过10_.
,达10分子水平缓解标准,但低于普通巢式RT—PCR),可检测MRD及患者是否达到分子水平缓解,对预测复发,指导后期临床诊疗,延长完全缓解期具有重要的临床价值.
6实时荧光定量RT—PeR检测APL—MRD尚需探讨的问题实时荧光定量RT—PCR技术作为最近出现的精确基因定量技术,其敏感性和可重复性为API的融合基因检测提供了更广阔的研究空间,而且创造性地解决了对MRD精确定量的检测,增强了有关对基因量变化的研究,为白血病临床诊断及MRD监测提供可靠方法I2船].
但此项工作开展不久,文献资料尚有限.
不同患者白血病细胞中基因表达量可能各有差异,所测得的定量结果是否能代表患者体内的肿瘤负荷,是否能对体内肿瘤负荷的变化作出精确定量分析,是否能以此对APLMRD发展和预后的动态监测等尚需更多的结果加以证实'.
7参考文献·393·1SanzMA.
All—transretinoicacidanthracyclinemonochemotherapyforthetreatmentofelderlypatientswithacutepromyelocyticleukemia.
Blood,2004,104(12):3490—3493.
2SanzMA,MartinG,LoCocoF.
Choiceofchemotherapyininduction,consolidationandmaintenanceinacutepromyelocyticleukaemia.
BestPractResClinHaematol,2003,16(3):433—451.
3GuBW,HuJ,XuL,eta1.
Feasibilityandclinicalsignificanceofreal—-timequantitativeRT—-PCRassayofPML—-RARe,phafusiontranscriptinpatientswithacutepromyelocyticleukemia.
HematolJ,2001,2(5):330—340.
4JureicJC.
MonituringPML/RARaphainacutepromyelocyticleukemia.
GurrOhcol,2003,5(5):391—398,5SchnittgerS,WeisserM,SchochC,etal,NewscorepredictingforprognosisinPML—RARe,+,AML/ETO+,CBF/MYH11acutemyeloidleukemiabasedonquantificationoffusiontranscripts.
Blood,2003,102:2746-2755.
6HiguchiT,KizakiM,OmineM.
Inductionofdifferentiati0n0fretinoicacid—resistantacutepromyelocyticleukemiacellsbythecombinationofall—transretinoicacidandgranulocytecolony—stimulating{actor.
LeukRes,2004,28(5):525—532.
7DarukaM,AlanFL.
Targetingthemultidrugresistance一1transporterinAML;molecularregulationandtherapeuticstrategies.
Blood,2004,104(7):1940—1951.
8李志刚,吴敏媛,朱平,等.
白血病29种染色畸变形成的融合基因分析.
中华儿科杂志,2001,39(11):682—685.
9TobalK,MooreH,MachetaM,eta1.
MonitoringminimalresidualdiseaseandpredictingrelapseinAPIbyquantitatingPML——RARalphatranscriptswithasensitivecompetitiveRT—.
PCRmethod.
Ieukemia,2001,15(7):1060—1O65.
10SlackJL,BiW,LivakKJ,eta1.
GallagherRE,WillmanCL.
Pre—clinicalvalidationofanovel,highlysensitiveassaytodetectPMI一RARalphamRNAusingreal—timereverse—transcriptionpolymerasechainreaction.
JMolDiagn,2001,3(4):141—149.
11陈赛娟,蔡敬仁,李秀松,等.
用逆转录酶一多聚酶反应检测早幼粒细胞白血病PML—RARe,融合基因.
中华血液学杂志,1993,14(I):3—5.
I2DavidG.
Genequantificationusingreal—timequantitativePCR:Anemergingtechnologyhitsthemainstream.
ExpHematol,2002,6(30):503—512.
13VisaniG,BuonamiciS,MalagolaM.
eta1.
PulsedATRAassingletherapyrestoreslong—termremissioninPML—RARalpha—positiveacutepromyelocyticleukemiapatients:realtimequantificationofminimalresidualdisease.
Apilotstudy.
Leukemia,2001,15(11):1696—1700.
14MoppetJ.
InhibitionaffectingRQ—PCR—basedassessmentofinacutelymphoblasticleukemiareversalbyadditionofbovine—serumalbumin.
LeukRes,2003,17(1):268—270.
15TallmanMS,RoweJM.
Long—termfollow—upandpotentialforcureinacutepromyelocyticleukaemia.
BestPractResClinHaematol,2003,16(3):535—543.
·394·16MannKK,RephaeliA,ColosimoAL,eta1.
Aretinoid/butyricacidprodrugovercomesretinoicacidresistanceinleukemiasbyinductionofapoptosis.
MolCancerRes,2003,1(12):903—912.
17LarsonRS,TallmanMS.
Retinoicacidsyndrome:manifestations,pathogenesis,andtreatment.
BestPractResClinHaematol,2003,16(3):453—461.
18WangZY.
TreatmentofAcuteLeukemiabyInducingDifferentiationandApoptosis.
Hematology,2003,1(1):63—69.
19GrimwadeD.
Thesignificanceofminimalresidualdiseaseinpatientswitht(15:17).
BestPractResClinHaematol,2002,15(1):137-158.
20GallgherRE,YeapBY.
Quantitativereal—timeRTPCRanalysisPML/RARamRNAinacutepromyelocyticleukemia:assessmentofprognosticinadlutpatientsfromintergroupprotocol0129.
Blood,2003,101:2521—2528.
21SirulnikA,MelnickA,ZelentA.
eta1.
Molecularpathogenesis国外医学输血及血液学分册2005年第28卷第5期ofacutepromyelocyticleukaemiaandAPLvariants.
BestPractResClinHaematol,2003,16(3):387—408.
22TallmanMS.
Crurativetheropeuticapproachestoacutepromyelocyticleukemia.
AnnHematol,2004,83(1):s81—82.
23LoCocoF,BrecciaM,DiverioD.
Theimportanceofmolecularmonitoringinacutepromyelocyticleukaemia.
BestPractResClinHaematol,2003,l6(3):503—520.
24卢学春,楼定方.
急性早幼粒细胞白血病对维甲酸耐药机制和复发后治疗.
国外医学输血及血液分册,2003,26(3):224—226.
25KwongYL,AuWY,ChimCS,eta1.
Arsenictrioxide—andidarubicin—inducedremissionsinrelapsedacutepromyelocyticleukaemia:clinicopathologicalandmolecularfeaturesofapilotstudy.
AmJHematol,2001,66(4):274—279.
(收稿El期:2005—01-27)(本文编辑:罗幼平)093.
因为ABO基因外显子7上单独的796C~A突变形成一新的cis—AB等位基因[英]/TzengCH…//Transfusion·一2005,45(1)·一50背景cis—AB极为罕见,已经报道过的符合此特殊的ABO等位基因改变的表型仅3例.
cis—AB01涉及A102等位基因外显子7上G803C非同义替换;然而cis—AB02和cis—AB03不同,分别是由于B101等位基因背景下A796C和C700T的非同义替换所致.
核苷酸置换使得各自的糖基转移酶发生改变,导致双功能AB转移酶活性变化.
研究设计与方法在一中国台湾家庭有两名以及两名无血缘关系的个体发现cis—AB表型.
采用血清学方法和分子克隆技术以及对外显子6、7测序,以检测他们各自的表型特征和cis—AB等位基因.
一组300名随机的AB型健康个体作为对照.
结果在3个家庭成员中发现了新的cis—AB等位基因,其发生796C~A替换,预示1O2等位基因的亮氨酸266残基改变为蛋氨酸.
此表型的血清学特征与cis—AB03形成的A2B表型相似,但分子不同.
2例无关个体均为cis—AB01等位基因,而所有的300例AB型对照组均不是cis—AB表型.
结论此中国家庭携带一新的cis—AB等位基因,其分子不同于所有以往报道过的cis—AB等位基因.
黄石市输血研究所周庆申摘译094.
以表面质粒基因组变异构现象快速定量血型抗原A、B特异性免疫球蛋白G抗体[英]/KimuraS…//Transfusi0n·一2005,45(1)·一56背景免疫球蛋白(Ig)G类A/B型抗体(抗一A/B)水平测定对于ABO一不匹配器官移植受者具有重要意义,去除这些抗体可有效改善预后.
现有的检测IgG类抗一A/B抗体方法存在缺陷,包括有高花费、低产出,以及对于自动化设备的适应性差.
研究设计与方法作者利用表面质粒基因组变异构现象(SPR)原理开发出一种检测IgG类抗一A/B抗体的快速检测方法.
为验证其准确性,作者对1名供者的血浆样品作系列稀释后以SPR方法检测.
此外,对于45例健康志愿献血者的血样同时以SPR方法和标准的试管法(TT)检测IgG类抗一A/B抗体滴度,其血浆曾用于2例ABO一不匹配器官移植的受者.
结果同一血样作系列稀释后,SPR检测结果清楚地反映了抗体滴度的变化.
SPR方法和TT方法检测IgG类抗一A抗体和IgG类抗一B抗体的相关系数分别为0.
85和0.
56.
SPR方法测得值与TT方法测得值结果亦相近,作双过滤血浆单采疗法或血浆置换疗法去除抗体后,均显示出抗体滴度的衰减.
结论此SPR方法可快速定量检测血浆中IgG类抗一A/B抗体滴度.
黄石市输血研究所周庆申摘译