基因首只警用克隆犬

微生物学通报JAN20,2008,35(1):73~77Microbiology2008byInstituteofMicrobiology,CAStongbao@im.
ac.
cn基金项目:山东农业大学青年科技创新基金(No.
23204)*通讯作者::xiezhijing@sohu.
com收稿日期:2007-05-15;接受日期:2007-06-11研究报告狐源犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因的克隆与序列分析吕品1胡传伟2杨笃宝1谢之景1*刘海防1(1.
山东农业大学动科院泰安271018)(2.
辽宁出入境检验检疫局技术中心大连116001)摘要:根据GenBank上发表的犬瘟热病毒(CDV)N基因核酸序列,设计一对CDVN基因特异性引物,采用RT-PCR扩增狐源CDV泰安分离株(CDV-FOX-TA)的N基因,将PCR产物克隆入pMD18-T载体,进行测序分析.
结果表明,CDV-FOX-TAN基因含有1个ORF,全长1572bp,共编码523个氨基酸.
CDV-FOX-TAN基因与CDV疫苗株Onderstepoort、Convac的N基因的同源性分别为96.
0%和95.
9%,与CDV野毒株N基因的同源性在98.
4%~98.
9%之间.
CDV-FOX-TAN蛋白含有Tyr-Pro-Ala-Leu-Gly-Leu-His-Glu-Phe九肽序列,是T细胞表位,可致敏靶细胞,在CDVN蛋白中高度保守.
对CDVN基因进行系统发生分析,结果发现CDV-FOX-TA与CDV强毒株的亲缘关系较为密切.
关键词:狐,犬瘟热病毒,N基因CloningandSequenceAnalysisoftheNGeneofCanineDistemperVirusTai'anIsolateinaFoxLV-Pin1HUChuan-Wei2YANGDu-Bao1XIEZhi-Jing1*LIUHai-Fang1(1.
AnimalScienceandTechnologyInstitute,ShanDongAgriculturalUniversity,Tai'an271018)(2.
LiaoningEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Dalian116001)Abstract:OnepairofprimerswasdesignedaccordingtotheNgenesofcaninedistempervirusstrainsreportedinGenBank.
TheNproteingeneofCDV-FOX-TAwasamplifiedwiththeprimersbyRT-PCR.
ThePCRproductwasclonedintopMD18-T.
Andthepositiverecombinantwasidentified,sequencedandanalyzed.
Asaresult,thelargeopenreadingframeoftheNgeneofCDV-FOX-TAincluded1572bp,whichencoded523aminoacids.
ThenucleotidehomologyoftheNgenesbetweenCDV-FOX-TAandCDVOndertepoortstrainwas96.
0%,anditwas95.
9%betweenCDV-FOX-TAandCDVConvacstrain.
However,thenucleotidehomologiesoftheNgenesofCDV-FOX-TAandtheCDVwildstrains,wasfrom98.
4%to98.
9%.
Anine-peptidesequenceintheNproteinofCDV-FOX-TAwasTyr-Pro-Ala-Leu-Gly-Leu-His-Glu-Phe,whichwasTlymphocytedefinedantigenandsenstizedtargetcells.
Onthebasisofphylogeneticanalysis,itimpliedthatCDV-FOX-TAandtheCDVwildstrainshadthesame74微生物学通报2008,Vol.
35,No.
1http://journals.
im.
ac.
cn/wswxtbcnancestor.
Keywords:Fox,Caninedistempervirus,Ngene犬瘟热(Caninedistemper,CD)是由犬瘟热病毒(Caninedistempervirus,CDV)感染引起的一种急性、高度接触性致死性传染病[1],以双向热、卡他性鼻炎、支气管炎、气管炎、严重的胃肠炎、神经症状为主要临床特征[2].
CDV是副粘病毒科麻疹病毒属成员,单股负链RNA病毒,基因组全长15690bp,共编码核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝蛋白(H)和大蛋白(L)6个结构蛋白[3].
CDVN蛋白是病毒结构中含量最多的结构蛋白,在病毒装配、转录和复制过程中起调控作用,并且能刺激机体产生强烈的抗体反应,即使当抗H蛋白和F蛋白的特异性抗体低于检测水平时,抗N蛋白的特异性抗体仍能被检测到[4],这对于CDV的早期诊断和预防有重要意义.
CDV不但可感染犬、狐、水貂等毛皮动物引起发病,而且还感染多种野生动物,严重危害我国养犬业、毛皮动物养殖业以及野生动物的健康发展[5].
本研究采用分子生物学技术对狐源CDV泰安株(CDV-FOX-TA)N基因进行了克隆与序列分析,发现CDV-FOX-TA与CDV强毒株的亲缘关系较为密切,这为预防CDV-FOX-TA的爆发流行提供了实验数据.
1材料和方法1.
1病毒与工程菌CDV-FOX-TA由本实验室分离,按培养量的1/10接种MDCK细胞,375%CO℃2条件下培养4d,待出现75%~80%细胞病变(CPE)时收毒,20℃保存备用.
工程菌DH5α购自宝生物(大连)工程有限公司.
1.
2试剂与仪器TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKit、TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKit、AMVReverseTranscriptase、反转录酶抑制剂(RNasin)、T4DNA连接酶、pMD18-T、DNAMarker、限制性内切酶BglⅡ、XbaⅠ等常规分子生物学试剂均购自宝生物(大连)工程有限公司,TaqplusDNApoly-merase购自上海生工公司,裂解液购自香港太太基因公司.
1.
3引物的设计与合成根据GenBank上发表的CDVN基因序列,利用DNAstar软件设计一对CDVN基因特异性引物,在上下游引物分别引入酶切位点Kpn/ⅠXhoI.
上游引物,5′-GGTACCAGGGTTCAGACCTACCAATATG--3′,下游引物5′-CTCGAGGGTCTTGAATATTTA-ATTGAGTAGC-3′,扩增片段1603bp.
1.
4CDV-FOX-TARNA的提取取200μLCDV-FOX-TA的MDCK细胞培养物,加入600μL裂解液和200μL氯仿,剧烈震荡,充分混匀后,412000℃r/min离心15min;吸取上清500μL至另一离心管内,加入500μL20℃预冷的异丙醇,上下颠倒5~6次,混匀,412000℃r/min离心15min,弃上清,加入600μL20℃预冷的75%乙醇,上下颠倒5~6次,混匀,412000℃r/min离心10min,弃上清,在超净工作台内自然晾干,加入20μLDEPC水溶解RNA沉淀.
1.
5CDV-FOX-TAN基因的RT-PCR扩增取CDV-FOX-TARNA10μL,加入20pmol/L上游引物1.
5μL,置70℃水浴5min,取出置冰上,随后加入5*RT-buffer2μL,10mmol/LdNTP2μL,5U/μLAMVReverseTranscriptase1μL,40U/μLRNasin0.
5μL,补加DEPC水至总体积为25μL.
将反应体系置42℃作用1h,进行反转录,之后70℃作用15min灭活AMV,即可得到cDNA.
PCR反应体系:10*PCR-buffer5μL,2.
5mmol/LdNTP8μL,20pmol/L上、下游引物各1μL,cDNA5μL,TaqplusDNApolymerase0.
3μL,补加灭菌三蒸水至50μL.
PCR反应参数:94℃预变性40s,94℃变性3min,55℃退火50s,72℃延伸120s,共进行35个循环,最后72℃再延伸10min.
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳确定其大小,回收目的片段.
1.
6CDV-FOX-TAN基因的克隆与序列分析将纯化的目的片段与pMD18-T载体16℃连接过夜,转化宿主菌DH5α,按试剂盒操作步骤提取质粒获得重组子pCDV/TA-N.
用限制性内切酶BglⅡ、XbaⅠ对pCDV/TA-N进行酶切鉴定,筛选阳性克隆,送宝生物(大连)工程有限公司测序,应用DNAStar软件对测序结果进行分析.
2结果2.
1CDV-FOX-TAN基因的RT-PCR、克隆与鉴定CDV-FOX-TAN基因的RT-PCR扩增片段为1603bp,与理论值一致,琼脂糖凝胶电泳结果见图1.
将CDV-FOX-TAN基因的扩增片段连接到吕品等:狐源犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因的克隆与序列分析75http://journals.
im.
ac.
cn/wswxtbcnpMD18-T载体上,获得pCDV/TA-N.
分别用限制性内切酶BglⅡ、XbaⅠ对pCDV/TA-N进行酶切鉴定,BglⅡ切出3328bp+967bp大小的片段,XbaⅠ切出4295bp大小的片段,结果与预期结果一致(见图2).
图2pCDV/TA-N酶切鉴定结果Fig.
2IdentificationofrecombinantplasmidpCDV/TA-Nbyrestrictionendonudeasedigestion.
1:DL15000+DL2000Marker;2:pCDV/TA-N/BglⅡ;3:pCDV/TA-N;4:pCDV/TA-N/XbaⅠ.
95.
9%;与标准强毒株A75-17N基因的同源性为98.
6%,与CDV小熊猫株(CDVLP)[6]N基因的同源性为98.
7%,与其他CDV野毒株N基因的同源性在98.
4%~98.
9%之间(见表1).
图1RT-PCR扩增结果Fig.
1TheresultofRT-PCR.
1:DL2000Marker;2:CDV-FOX-TAN基因的RT-PCR产物1:DL2000Marker;2:TheRT-PCRproductofCDV-FOX-TANgene2.
3CDV-FOX-TAN基因系统发生分析CDVN基因系统发生分析结果,CDV可分为两大谱系,一大谱系由CDV疫苗株构成,另一大谱系由CDV野毒株构成(见图3).
CDV-FOX-TA与CDV野毒株的亲缘关系较为密切.
2.
2CDV-FOX-TAN基因的同源性分析CDV-FOX-TAN基因与2个CDV疫苗株Onder-stepoort、ConvacN基因的同源性分别为96.
0%和表1CDV-FOX-TAN基因序列同源性分析结果Table1ThehomologyanalysisresultoftheNgenesofCDV-FOX-TAandtheotherCDVstrains同源性(Percentidentity)1234567891011194.
793.
893.
894.
794.
994.
894.
794.
896.
099.
525.
697.
797.
799.
598.
598.
598.
599.
898.
694.
636.
52.
499.
998.
298.
298.
298.
297.
998.
793.
746.
52.
40.
198.
298.
298.
298.
297.
998.
893.
755.
60.
51.
91.
998.
898.
898.
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698.
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665.
31.
61.
91.
91.
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875.
51.
61.
91.
91.
20.
299.
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494.
685.
61.
61.
91.
91.
20.
20.
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22.
12.
10.
41.
41.
41.
498.
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7104.
01.
51.
41.
21.
11.
31.
61.
51.
195.
9差异性(Divergence)110.
75.
76.
66.
65.
75.
55.
65.
75.
64.
31:Onderstepoort;2:A75-17;3:CDV-LP;4:CDV-5804;5:CDV-00-2601;6:CDV-98-2645;7:CDV-98-2654;8:CDV-98-2646;9:CDV-01-2689;10:CDV-FOX-TA;11:Convac76微生物学通报2008,Vol.
35,No.
1http://journals.
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cn/wswxtbcn图3CDVN基因系统发生树Fig.
3PhylogenetictreeoftheCDVNgenes3讨论CDVN蛋白是CDV结构中含量最多的结构蛋白,含有T淋巴细胞表位与B淋巴细胞表位,在细胞免疫和体液免疫中发挥重要的作用.
CDV-FOX-TA有一个ORF,全长1572bp,编码523个氨基酸.
CDVN蛋白分为三个区,N端可变区、C端可变区和中间高度保守区[4,7].
CDV-FOX-TA与其他CDV毒株的差异主要表现在N端和C端可变区,408-519位氨基酸呈现高变态势,但这些差异并不影响CDV的生物学特性[8-11].
CDVN蛋白含有一个Tyr-Pro-Ala-Leu-Gly-Leu-His-Glu-Phe九肽序列,可致敏靶细胞[12,13],使细胞溶解产生CTL反应,为N蛋白Ld限制表位,是T细胞表位,在N蛋白中高度保守,但是不同的CDV毒株间也会出现个别氨基酸的变异,但目前尚不清楚变异对整个CDVN蛋白的结构及功能的影响,在CDV-FOX-TAN蛋白的相同位置也存在这个九肽序列.
对CDVN基因进行同源性分析表明,CDV-FOX-TAN基因与CDV强毒株N基因的同源性相对较高,与CDV疫苗株N基因的同源性相对较低;对CDVN基因进行系统发生分析,发现CDV-FOX-TA与CDV强毒株的亲缘关系较为密切.
CDVN蛋白是相对保守的,这对CDV的繁殖生存有重要意义.
CDVN蛋白在CDV的装配、转录和复制过程中起调控作用[14,15],与CDV的毒力密切相关[16,17],如发生较大的变异则不利于CDV的繁殖和生存,即使CDVN基因序列发生变异,大多数突变是同义突变,不会影响氨基酸序列,相应的生物学功能也不会发生改变.
CDV分布广泛,并不断进化,能在种间传播流行,CDV宿主范围不断扩大[18,19],给CD的防治带来困难.
目前,CDV疫苗接种是控制CDV流行的主要手段,因CDVN蛋白相对保守,所以CDVN基因是研制CDV基因工程疫苗的首选基因.
并且,CDVN蛋白能刺激机体产生免疫反应,特别是当抗H蛋白和F蛋白的特异性抗体低于检测水平时,抗N蛋白的特异性抗体仍能被检测到,所以CDVN蛋白在CDV早期诊断中具有重要的意义,我们对本实验室分离的CDV-FOX-TAN基因进行了克隆及序列分析,为以后开发CDV的诊断试剂和研制有效的基因工程疫苗提供了实验资料,并为防治CDV-FOX-TA的爆发流行提供了分子流行病学资料.
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9(8):10761080.
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cn或电话010-64807511《微生物学通报》编辑部2007年8月29日