转基因抗虫棉邯郸

885安全评价资料邯郸市农业科学院1转基因抗虫棉邯郸885安全评价资料一、转基因抗虫棉生产应用安全证书申请表项目名称单价BtCry1A抗虫棉邯郸885在黄河流域生产应用的安全证书申请品种(系)名称邯郸885受体生物及品种棉花,泗棉3号外源基因基因1GFMCry1ABt杀虫基因功能抗棉铃虫基因2NptII功能选择标记基因基因3Gus功能报告基因母本名称邯郸284是否为转基因品种是√否父本名称邯郸109(邯4104*GK12)是否为转基因品种√是否选育方式及世代1995年以邯4104为母本与泗棉3号抗虫系(GK12)杂交,历3年时间育成邯郸109.
1998年以邯郸284为母本,邯郸109为父本配制杂交组合,进行邯郸885的世代选育:1998年冬海南种植F1;1999年扩种F2,同年冬海南选育F3;1999年种植F4单株,1999年冬南繁F5;2000年鉴定F6优系,冬天在海南进行优系单株的鉴定.
原审批安全证书资料审批号农基安证字(2005)第113号转基因生物名称邯郸885生产应用区域河北省有效期2005年12月20日至2010年12月31日转基因抗虫棉适宜生态区域(可多选)√黄河流域长江流域西北内陆拟申请使用的年限2008年11月-2013年11月申请单位概况单位名称申请人联系人联系电话0310-8161725电子邮件通讯地址2二、已取得生产应用安全证书的转基因抗虫棉生产应用情况总结报告邯郸885是邯郸市农业科学院选育的转基因抗虫棉品种.
该品种的选育涉及两次杂交,以邯4104为母本与泗棉3号抗虫系(GK12)杂交,育成邯郸109;以邯郸284为母本,邯郸109为父本配制杂交组合,育成邯郸885.
其中GK12和邯郸109为转基因抗虫棉,邯4104和邯郸284两亲本均为自育的优良品种.
(一)、邯郸885品种主要特征特性描述生育期131天左右,属中熟品种类型.
该品种种子较大,成熟度好,褐色种皮,被短绒.
出苗较齐,出苗后长势旺,发育快,前期长势强.
幼苗子叶肥大.
植株高大,株高82.
3厘米,株型稍松散,茎秆粗壮,茸毛稀少,抗风直立,不倒伏;叶片较大,缺刻深,叶色浓绿,叶片厚,叶功能好;果枝长,单株果枝数11.
6个,第一果枝节位6.
9;全生育期生长势强,生长稳健,后期不早衰;棉铃椭圆型,棉铃大,单铃重6.
2克左右,铃壳薄,吐絮畅,色洁白,衣分41.
8%,易采摘,子指11.
5克,产量潜力大.
抗枯萎病,耐黄萎病.
高抗棉铃虫,对棉铃虫具有极显著的抗性,试种表明,一、二代棉铃虫发生期可不用化学防治,三、四代棉铃虫发生期一般只须防治2-3次,较常规品种约减少用药50%-70%.
(二)、邯郸885主要试验结果产量高,增产幅度大.
区试中,霜前子棉、皮棉、霜前皮棉亩产量分别为238.
6公斤、104.
3公斤、99.
6公斤分别较对照99B增产323.
2%、29.
5%、31.
9%,均居首位,与参试品种相比,增产显著.
抗逆性强,适应性广.
利用田间笼罩,在笼内种植,鉴定抗虫结果,邯郸885抗虫性较好,对棉铃虫达抗性水平.
前期对棉盲蝽也有一定的驱避性.
抗枯萎病,耐黄萎病,对角斑病和轮纹病等多种病害,也有较好抗性.
后期叶片功能好,不早衰,具有一定的耐旱性.
纤维品质优.
纤维品质优良,经多年多次取样,由农业部棉花纤维品质检验中心测试.
平均结果,2.
5%跨长30.
8毫米,比强度30.
1cN/tex,马克隆值4.
3,整齐度84.
8%,伸长率6.
0,综合品质优良.
(三)、邯郸885对棉铃虫抗性监测结果委托中国农科院棉花研究所对该品种的抗棉铃虫性能进行了监测.
杀虫蛋白定量检测结果:邯郸802苗期、蕾期、花期、和铃期棉叶中Bt杀虫蛋白表达量均高于当地主载抗虫棉品种,其中苗期、蕾期的差异极显著水平,花期差异达显著水平,蕾期小蕾中Bt杀虫蛋白表达量高于当地主载抗虫棉品种,差异达极显著水平.
对靶标害虫抗性效率检测结果:邯郸885在二代、三代和四代棉铃虫发生期,百株幼虫数量、顶尖被害率和蕾铃被害率均低与其受体品种,差异达极显著水平;和当地主栽抗虫棉品种(中棉所41)相比,其中二代棉铃虫发生期顶尖被害率降低,差异达极显著水平,其他指标均无明显差异.
抗性稳定性和纯合度检测结果:邯郸885苗期和花铃期的抗性明4显高于蕾期,差异分别达极显著和显著水平,苗期和花铃期抗性差异不显著.
和当地主载抗虫棉品种相比,邯郸885花铃期抗性明显增强,差异达极显著水平,苗期和蕾期的抗性差异不明显.
5三、所申请转基因抗虫棉的选育过程(一)、立项背景和选育目标棉花是重要的经济作物之一,其种植、加工、纺织等相关从业人员众多,对农村经济的发展和农民的经济收入具有非常重要的影响,因此棉花生产历来受到党和政府各级部门的重视.
但是,由于受到气候、市场等各种因素的影响,棉花生产的发展一路走来,颇多挫折,在其发展历程中,为稳定、促进棉花生产,优良棉花品种的应用发挥了巨大作用.
因此,新品种的选育对棉花生产的持续性发展至关重要.
自上世纪九十年代始,我国黄河流域棉区棉铃虫连年爆发危害,化学农药防治效果很难实现预期的效果,环境污染严重,农药中毒现象增多,广大棉农谈虫色变,植棉积极性受到严重挫伤.
同时,自然气候多变,灾害频繁,低温、阴雨等恶劣天气常发,棉花枯萎病和黄萎病危害也日趋严重,尤其黄萎病,因为缺少抗源材料,品种抗性水平普遍较低,病害大发生年份,生产损失很大,棉花生产连年萎缩,棉花几近沦为小作物,而且年度间波动很大.
另外随着社会经济的发展,棉花后续的加工及相关产业又对棉花的品质提出了较高的要求.
棉花是重要的工业原料,纤维品质关系其应用价值,尤其比强度高低也成为衡量棉花品种优劣的重要指标.
随着纺织工艺的改进,人们生活水平的提高,我国加入WTO,都对棉花纤维品质提出了新的要求.
这便对棉花品种的抗逆性、丰产性、早熟性及纤维品质提出了更高的要求,也把一个严峻的课题摆在了育种者面前,育成的棉花品种必须满足这些要求才会更有应用价值,也才会具有发展的生命力.
6根据上述自然生态条件要求和社会经济需求,立足棉花生产一线,为适应社会、经济对棉花品种产量和品质的要求,适时调整工作方向,把选育产量更高,品质更优,抗病早熟,适应性广,稳定性强的转基因抗棉铃虫棉花新品种作为首要目标,以期为促进棉花生产的发展,逐步提高棉农收入贡献一份力量.
(二)、亲本组合及来源邯郸885的二次杂交组合为邯郸284*邯郸109,两亲本均为自育的优良品种.
其中邯郸284组合为(83-4.
366*中12)F1*(85-0.
044*冀棉11)F1,83-4.
366是冀棉1与冀棉2杂交后育出的丰产品系,85-0.
044是从河北省植保所引进的抗病材料,其亲本组合为徐州1818*登恩119.
邯郸109为邯4104与泗棉3号抗虫系(GK12)培育的转Bt基因抗虫棉品种,表现植株高大,株型松散,叶色浓绿,叶片较大,结铃集中桃大絮肥,纤维洁白,抗病性强,高抗棉铃虫,适应性好.
(三)、邯郸885选育世代1995年以邯4104为母本与泗棉3号抗虫系(GK12)杂交,历3年时间育成邯郸109.
1998年以邯郸284为母本,邯郸109为父本配制杂交组合,进行邯郸885的世代选育:1998年冬海南种植F1;1999年扩种F2,同年冬海南选育F3;1999年种植F4单株,1999年冬南繁F5;2000年鉴定F6优系,冬天在海南进行优系单株的鉴定;72001年将从海南选回的优良单株进行原原种繁育.
(四)、主要试验结果产量高,增产幅度大.
区试中,霜前子棉、皮棉、霜前皮棉亩产量分别为238.
6公斤、104.
3公斤、99.
6公斤分别较对照99B增产23.
2%、29.
5%、31.
9%,均居首位,与参试品种相比,增产显著.
抗逆性强,适应性广.
抗棉铃虫,前期对棉盲蝽也有一定的驱避性.
抗枯萎病,耐黄萎病,对角斑病和轮纹病等多种病害,也有较好抗性.
后期叶片功能好,不早衰,具有一定的耐旱性.
纤维品质优.
纤维品质优良,经多年多次取样,由农业部棉花纤维品质检验中心测试.
平均结果,2.
5%跨长30.
8毫米,比强度30.
1cN/tex,马克隆值4.
3,整齐度84.
8%,伸长率6.
0,综合品质优良.
(五)、品种主要特征特性描述生育期131天左右,属中熟品种类型.
该品种种子较大,被短绒,褐色种皮.
出苗一般,但出苗后长势旺,发育快,前期长势强.
幼苗子叶肥大.
植株高大,株高82.
3厘米,株型稍松散,茎秆粗壮,茸毛稀少,抗风直立,不倒伏;叶片较大,缺刻深,叶色浓绿,叶片厚,叶功能好;果枝长,单株果枝数11.
6个,第一果枝节位6.
9;种子发芽出苗性能较好,前期生长发育快,全生育期生长势强,生长稳健;棉铃椭圆型,棉铃大,单铃重6.
2克左右,铃壳薄,吐絮畅,色洁白,衣分41.
8%,易采摘,子指11.
5克.
8四、申请单位农业转基因生物小组审查意见我国是产棉大国,年原棉产量约占全世界产棉总量的25%.
但近年来由于棉花虫灾的大爆发,年单产损失平均在30%-40%,经济损失巨大,间接损失超过百亿元.
使用化学农药防治害虫,不仅污染土质环境,破坏有益生态平衡,而且害虫产生耐药性逐年提高,用药量剧增,棉农中毒或死亡的事件不断发生.
仅92年至95年间,中毒人数近200000人次,死亡人数超过7000人,给棉农的生命安全带来很大危害.
在国家的大力资助下,我国人工合成了Bt杀虫基因,并导入棉花获得了具有高抗棉铃虫的中国第一代抗虫棉、使我国成为居美之后,研制成功抗虫棉的第二个国家,达国际先进水平.
目前所进行的杂交抗虫棉研究又取得了突破,已进入推广应用阶段.
这不仅具有理论意义,巨大的经济价值,而且具有重大社会效益,意义重大.
Bt作为首选生物农药,在田间使用已有50多年历史,没有发现不安全的问题,抗虫棉的抗虫基因是按照Bt杀虫蛋白人工合成的,所以杀虫基因是安全的.
棉花已有几千年的栽培史,所用品种高度驯化,生长繁殖受到人类控制,而且棉花起源中心不在中国,野生种分布很少,并与其它植物存在杂交不亲和性,所以受体是安全的.
而且美国和澳大利亚的抗虫棉(B.
t.
抗虫基因)已大面积推广应用,所以抗虫棉具有很好的安全性.
同意申报.
单位公章小组组长(签章)年月日9五、申请单位意见该项目成果优点突出,具有较好的技术先进性和很好的基因安全性,对棉花生产具有重要意义,研究过程具有具体严密的组织措施和安全控制措施.
根据安全管理小组的审查意见,同意申报.
单位公章负责人(签盖)年月日10转基因抗虫棉GK12安全评价资料一、国内外研究的相关背景资料苏云金芽孢杆菌是一种能形成芽孢的革兰氏阳性土壤芽孢杆菌,已知其可产生对多种昆虫,如鳞翅目(Lepidopterans)、鞘翅目(Coleopterans)和双翅目(Dipterans)等作物害虫有毒性的伴孢结晶蛋白质.
由于其杀虫的专一性和高度选择性,所以对植物和包括人在内的动物没有毒害,而且是环境可以接受的.
随着DNA重组技术发展,自80年代后期以来,许多实验已将Bt.
基因导入到不同植物组织的细胞中,并已在被转化的细胞和植物中表达了嵌合基因.
已经证明利用基因操作技术导入转基因植物中的工程化遗传特性是稳定的,并且证明可通过正常孟德尔遗传将工程化改造的遗传特性(例如杀虫能力)传递给转基因植物的后代.
例如,Vaeck等人(Nature328:33-37,1987)将编码Bt杀虫蛋白质的DNA序列修饰或剪切成约1/2长度,然后整合到烟草基因组中并成功地生产出抗虫烟草植株.
Fischhoff等人(Bio/Technology5:807-813,1987)用类似的方法成功地产生了被Bt杀虫基因转化的蕃茄植株.
Barton,K.
A.
和Umbeck,P.
F.
(PCT89004868)描述了能够在植物细胞中表达Btδ-内毒素氨基端部分(约700氨基酸)的嵌合基因的构建,以及用携带所说嵌合基因的重组载体转化植物细胞,以产生表达该毒素的转基因植物的方法.
但上述研究由于未对Bt基因微生物来源的密码子进行改造,转基因植物中杀虫蛋白质的表达量很低.
Perlak等人(Bio/Technology8:939-942,1990)按照双子叶植物优化密码子,以化学合成方法合成了11衍生于B.
t.
(kurstakiHD-1,CryIA(b))和HD-73,CryIA(c))的嵌合基因,其3'端的1/2序列被缺失,且改变了部分保守序列的密码子.
所得到的基因序列包含相当于编码615氨基酸序列的1845bp.
将基因导入棉花后,其中杀虫蛋白质表达量约为天然Bt基因表达量的50-100倍(约占叶子中可溶性蛋白质的0.
05%-0.
1%).
国际上有关Bt基因及其转基因植物的专利还有很多,这里不再一一赘述.
尤其,美国孟山都公司人工合成了Cry1AbBt杀虫基因,获得了转基因抗虫棉花,并先于我国进入了产业化阶段.
目前,美国抗虫棉在美国的种植面积达到了其植棉总面积的60%以上.
此外,在澳大利亚、土耳其、印度以及包括中国等在内的多个国家进行了商品化推广.
我国863计划于1991年立项开展抗虫棉的研究,1996年又将"抗虫棉的研制"列为重大关键技术项目,予以重点资助.
此外,中华农业科教基金、农业部发展棉花专项资金、科技部转基因植物产业化专项、国家计委产业化项目等先后对抗虫棉的研究及产业化进行了大力资助.
目前,在国内多家科研及育种单位的密切合作下,经过10年的艰苦努力,在单价、双价抗虫棉的研究及其产业化方面均取得了突破性进展.
在单价抗虫棉研究方面,设计并合成了适于在植物中表达的苏云金芽孢杆菌GFMCry1ABt杀虫基因,构建了可在植物中高效表达杀虫基因的表达载体,通过农杆菌介导法和花粉管通道法导入棉花,研制成功了单价抗虫棉.
为防止棉铃虫对单价棉产生抗性,我国科学家又创造性地开展了双价抗虫棉的创新研究.
将人工合成的GFM12Cry1ABt基因与修饰后的CpTI(豇豆胰蛋白酶抑制剂)基因构建在一起导入棉花中,研制成功了能同时在棉花中产生两种不同机理的杀虫蛋白的双价抗虫棉.
CpTI基因产生的杀虫蛋白可通过抑制昆虫消化酶的消化功能使昆虫产生厌食反应,并导致昆虫死亡.
这两种杀虫蛋白的功能具有互补性和协同增效性.
使双价抗虫棉不但可以有效延缓昆虫对单价抗虫棉产生抗性,而且可增强抗虫性.
应用普通棉铃虫和抗性棉铃虫(人工汰选获得的对Cry1Ac杀虫蛋白抗性指数为16倍的棉铃虫)进行的研究表明,尽管两种抗虫棉对低龄普通棉铃虫种群的杀虫活性基本相当,但在单价棉杀虫活性随着棉花生育期的增长和棉铃虫抗性增长出现明显下降时,双价棉仍存在较高的杀虫活性;双价棉处理抗性和对照棉铃虫种群,均只有5龄幼虫才可部分化蛹和羽化,而单价抗虫棉2~5龄均可部分化蛹和羽化,并随着龄期的增大,化蛹率和羽化率也逐渐增加.
这说明,双价棉在对抗性棉铃虫的杀虫效果和生长发育抑制作用等方面较单价抗虫棉具有明显的优势,预计将对控制抗性发展起到关键作用.
在抗虫棉的研究期间,也分别开展了转基因抗虫棉的产品动物安全性研究、田间靶标昆虫及非靶标昆虫种群动态研究、抗性治理技术研究、抗虫棉品种(系)选育的研究、抗虫杂种棉的组配研究、抗虫棉试种示范研究、抗虫性遗传规律等方面的研究,均取得了一系列重要结果,为抗虫棉的产业化提供了科学依据.
研究成果与核心技术的立体交叉集成,为抗虫棉的产业化打下了坚实的基础.
尤其,在转基因抗虫棉的安全性研究方面也取得了许多重要研究结果.
13在Bt棉的抗性治理技术方面:(1)Bt棉在田间对二代棉铃虫幼虫有极强的杀伤力,人工接种初孵和4日龄幼虫皆不能成活,田间Bt棉基本无危害现象,顶尖及蕾受害率一般小于1%,而非转基因棉的顶尖及蕾受害率达40-90%.
因此在抗虫棉上二代棉铃虫不需喷药防治.
(2)随着棉花的生长发育,Bt棉后期的抗虫性有所减弱.
通过分期播种试验(310月),初步明确Bt棉的抗虫性主要受棉花生育期的影响.
(3)三、四代棉铃虫是否需喷洒农药,决定于某一特定年份或特定地区的虫口密度.
百株虫卵数不适于作为喷药防治的指标,因它未考虑抗虫棉对棉铃虫的杀伤力.
应以百株幼虫数作为喷药防治的指标.
按产量损失3%计算,在华北地区百株低龄幼虫数达到13头可作为喷药防治三代棉铃虫的指标.
(4)GK系列Bt棉对棉铃虫抗性的田间评价:在河北廊坊及河南新乡进行的系统调查显示,GK12和GK2两个品种(系)在整个生育期对棉铃虫皆保持90%以上的极高抗性.
(5)经对我国五大棉区23个点的棉铃虫种群采样,分析Cry1Ac蛋白对不同种群的ID50(抑制50%的初孵幼虫长至3龄),证实我国各地棉铃虫种群尚未对Bt杀虫蛋白产生抗性,这一基线信息对监控棉铃虫的抗性发展及采取恰当的抗性治理对策十分重要.
(6)国外对Bt抗虫棉的抗性治理多采用"高剂量/庇护所"策略,我国除新疆棉区外,其它棉区不适于采取Bt棉与非Bt棉同时种植的"庇护所"策略.
这些棉区多采用多种作物混作的耕作制度,因此实际上已提供了天然的"庇护所".
研究发现棉铃虫对Bt棉和Bt玉米存在交互抗性,因此,不宜在同一地区同时推广Bt抗虫棉及Bt抗虫玉米,以降低14Bt对棉铃虫及亚洲玉米螟的选择压,延缓害虫对Bt耐性的发展速度.
(7)依据Bt棉连续汰选棉铃虫的抗性增长及棉铃虫抗性适应的模拟模型,预测至少在10年内单价Bt棉可在生产上有效控制棉铃虫的危害.
因田间情况比较复杂,这一推测尚需在田间作进一步验证.
(8)双价棉的抗虫性与单价Bt棉一样,也表现为前期强,后期弱,但双价抗虫棉蕾和花的杀虫活性比单价Bt棉高;双价抗虫棉对2龄以上抗Bt棉铃虫的杀虫活性和抑制生长作用明显增强.
14龄抗Bt棉铃虫幼虫连续取食双价棉叶后均不能化蛹,只有从5龄开始取食才有部分幼虫化蛹,而抗Bt棉铃虫2龄幼虫取食单价Bt棉叶片后可以部分化蛹.
(9)Bt棉田非靶标害虫的种群变化:Bt棉田由于在二代棉铃虫发生期间不需喷药,瓢虫类、草蛉类、蜘蛛类等捕食性天敌的数量大幅度增加,有效地控制了蕾铃期棉蚜种群的发展.
对照棉花泗棉3号和石远321分别用菊酯类或有机磷农药防治2代棉铃虫4次,结果导致蕾铃期棉蚜大发生,百株3叶累计棉蚜数量比Bt棉GK12高443-1546倍.
但与此同时,在Bt棉田中,天敌控制作用较弱的盲蝽蟓及红蜘蛛上升为重要害虫,应注意防治.
在Bt棉的动物毒理学研究方面:(1)以环磷酰胺作为阳性诱变剂,普通棉的棉籽及棉籽油作为对照,同时设阴性对照组,检查Bt棉棉籽、棉籽油饲喂小鼠后骨髓嗜多染红细胞的微核率和精子畸变率,结果表明,Bt棉与普通棉的棉籽及棉籽油对小鼠的体细胞和性细胞均没有诱变活性,且没有剂量效应,对小鼠的食欲、肝、脾、肾亦无影响.
(2)斑马鱼(Branchynaniorerio)的遗传毒理学实验同样15表明:从微核率和精子畸变率上看,长期饲喂Bt棉棉籽及棉籽油的饲料,对斑马鱼无诱变活性和剂量效应;对受试鱼的大体解剖及组织病理检查均没有发现异常.
(3)以单、双价转基因抗虫棉的棉籽仁粉和棉籽油为实验材料进行的家兔的眼刺激试验、皮肤刺激试验,大鼠的经皮毒性试验、经口毒性试验同样表明转基因抗虫棉产品对试验动物属实际无毒.
二、安全性评价1受体植物的安全性评价1.
1受体植物的背景资料1.
1.
1学名、俗名和其它名称受体植物学名为GossypiumL.
,俗名棉花,在我国栽培种主要是陆地棉,此外还包括海岛棉、草棉和亚洲棉.
1.
1.
2分类学地位棉花是最古老的作物之一,在世界范围内被广泛种植,它的栽培与农业的起源同时发生.
棉花在分类上属于双子叶植物纲(Dicotylwdoneae),锦葵科(Malvaceae),棉属(GossypiumL.
).
1978年,美国植物学家P.
A.
Fryxell将棉属植物分成了4个亚属,7个组,10个亚组,39个种.
其分类系统如下:棉属GossypiumLinnaeus棉亚属Sturtia(R.
Brown)todaroⅠ组:Sturtia1.
斯特提棉G.
sturtianumJ.
H.
Willis162.
南岱华棉G.
Sturtianumvar.
nandewarense(Derera)Fryxell3.
鲁宾逊氏棉G.
robinsoniiF.
vonMuellerⅡ组大萼组GrandicalyxFryxell4.
皱壳棉G.
costulatumTodaro5.
小丽棉G.
Pullchellum(C.
A.
Gardner)Fryxell6.
杨叶棉G.
PopulifoliumF.
vonMuellerexTodaro7.
长茸棉G.
PilosumFryxell8.
肯宁汉氏棉G.
CunninghamiiTodaroⅢ组似木槿组HibiscoideaTodaro9.
澳洲棉G.
australeF.
vonMueller10.
奈尔逊氏棉G.
nelsiniiFryxell11.
比克氏棉G.
bickiiProkhanov12.
三叶棉G.
triphkyllum(Harvey)Hochreutiner棉亚属HouzingeniaFryxellⅣ组:HouzingeniaⅣa亚组:Houzingenia13.
三裂棉G.
trilobum(Mocono&SesseexDC.
)Skovsted14.
瑟伯氏棉G.
thurberiTodaroⅣb亚组:Integrifoliatodaro15.
克劳茨基棉G.
klotzchianumAndersson1716.
戴维逊氏棉G.
dacidsoniiKelloggⅣc亚组:Caducibracteolatamauer17.
哈克尼西棉G.
harknessiiBrandegee18.
辣根棉G.
armourianumKearney19.
特伦纳氏棉G.
turneriFryxellⅤ组:棉毛木组Erioxylum(Rose&Standley)ProkhanovⅤa亚组:aErioxylum(Rose&Standley)Prokhanov20.
旱地棉G.
aridum(Rose&Standley)Skovsted21.
松散棉G.
laxumPhillips22.
裂片棉G.
lobatumGentryVb亚组:Selera(ulbrich)Fryxell23.
拟似棉G.
gossypioides(Ulbrich)StandleyVc亚组:南美棉亚组AustroamericanaFryxell24.
雷蒙德氏棉G.
raimondiiUlbich棉亚属GossypiumⅥ组:GossypiumⅥa亚组:Gossypium25.
亚洲棉G.
arboreumL.
26.
草棉G.
herbaceumL.
Ⅵb亚组:畸形亚组AnomalaTodaro27.
异常棉G.
anomalumwawra&peyritch28.
绿顶棉G.
capitis-viridisMauer18Ⅶ组:PeudopambakProkhanovⅦa亚组:Peudopambak29.
司-克氏棉G.
stocksiiMastersexHooker30.
索马里棉G.
somalense(Gurke)J.
B.
Hutchinson31.
灰白棉G.
incanum(Schwartz(Hillcoat32.
亚雷西棉G.
areysianumDeflersⅦb亚组:长裂亚组longilobaFryxell33.
长萼棉G.
longicalyxHutchinson&Lee棉亚属KarpasRafinesque34.
夏威夷棉G.
tomentosumNuttallexSeemann35.
矛叶棉G.
lanceolatumTodaro36.
陆地棉G.
hirsutumL.
37.
海岛棉G.
barbadenseL.
38.
黄褐棉G.
MustelinumMiersexWatt39.
达尔文氏棉G.
darwiniiWatt1985年美国学者J.
E.
Endrizzi等人将棉属分为41个种,增加了原产非洲的非洲棉变种G.
herbaceumvar.
africanum(Watt)mauer和野生二倍体种爱伦拜克氏棉[G.
ellenbeckii(gürke)Maner].
在棉属植物中,农业栽培棉种主要有4个,即陆地棉(G.
hirsutum)、海岛棉(G.
barbadense)、草棉(G.
herbaceum)和亚洲棉(G.
arboreum).
关于栽培棉种的起源目前认为:草棉和亚洲棉都是由非洲野生棉分化与进化而来;陆地棉和海岛棉起源于A染色体组和19D染色体组二个不相类似的种间杂交,伴之以后的染色体加倍而形成,这为大多数学者所承认.
1.
1.
3试验用受体植物品种(或品系)名称;泗棉3号(GK12受体品种).
1.
1.
4是野生种还是栽培种泗棉3号为栽培种.
1.
1.
5原产地及引进时间陆地棉(G.
hirsutum)起源于墨西哥高原南部地区,在墨西哥南部及尤卡坦地区,此棉种向南扩展到巴拿马地峡地带,向东北扩展到亚利桑那沙漠,向东及东北扩展到佛罗里达、安的列斯群岛及巴哈马.
在美洲被发现以后,这个棉种获得了头等重要意义,在全世界广泛传播,在亚洲、非洲、欧洲、及南美等地各个产棉国家广泛种植,并不断排挤当地棉种.
我国种植棉花历史悠久,早在2000多年前,我国华南和新疆已先后引种亚洲棉和草棉.
在20世纪初叶,我国已开始了亚洲棉育种工作.
在30年代从美国引进了陆地棉品种,在40年代开始推广,同时也逐步开展了其育种工作.
本研究所用受体材料泗棉3号为我国常规棉花品系.
1.
1.
6用途棉花是我国重要的经济作物,主要种植目的是收获棉花纤维,作为纺织业原料.
此外,棉籽油和棉籽蛋白是重要的植物油和蛋白质资源,分别占世界食用植物油和蛋白质总供应量的10%和6%,棉花的短20绒、棉籽壳、棉杆、棉酚等都有工业用途.
1.
1.
7在国内的应用情况我国既是产棉大国,也是原棉消费大国;既是原棉进口大国,又是原棉和棉制品出口大国.
植棉史在我国已有2000年左右.
改革开放以来的近20年中,我国棉花无论面积还是单产水平和总产均跻身于世界先进植棉大国的行列.
因此棉花生产的兴衰对我国经济的发展具有举足轻重的影响.
八十年代我国常年植棉面积600~630万公顷,占世界总植棉面积的1/5~1/6,居世界第二位.
常年总产皮棉450万吨左右,占世界总产的1/3~1/4,居世界第一位.
常年原棉消费量450万吨左右,也占世界总消费量的1/4,居世界第一位.
植棉总产值占整个种植业总产值的7%~10%.
本试验所用的受体棉花材料曾大面积推广.
1.
1.
8对人类健康和生态环境是否发生过不利影响棉花已有几千年的栽培历史,未见对人类健康和生态环境是否发生过不利影响.
1.
1.
9从历史上看,受体植物演变成有害植物(如杂草等)的可能性;棉花不会演化成有害的植物.
所用品种已高度驯化,其生长繁殖受到人类的控制.
另外,棉花起源中心不在我国,棉花的野生种在我国分布很少,而且大多存在杂交不亲和性.
1.
1.
10是否有长期安全应用的记录棉花已有几千年的栽培及其产品的应用历史,具有长期安全应用21的记录.
1.
2受体植物的生物学特性1.
2.
1是一年生还是多年生我国栽培棉花为一年生的品种(不包括在海南岛种植的棉花),在我国大部分地区春季或夏初播种,秋天收获.
1.
2.
2对人及其它生物是否有毒,如有毒,应说明毒性存在的部位及其毒性性质棉株所含的棉酚是很活泼的化合物,它的化学结构式中有6个羟基,2个羧基,这些基团可以同氨基酸化合,因此对人和单胃动物具有一定毒性.
1.
2.
3是否有致敏原,如有,应说明致敏原存在的部位及其致敏特性未发现致敏原.
1.
2.
4繁殖方式为有性繁殖还是无性繁殖,如为有性繁殖,是自花授粉还是异花授粉或常异花授粉;是虫媒传粉还是风媒传粉棉花是靠种子繁育的,也就是有性繁殖.
属常异花授粉植物,为虫媒授粉.
1.
2.
5在自然界中与同种或近缘种的异交率在自然界中,棉花栽培种内的天然异交率在1%-10%,高的可达20%.
棉属有39个种,其中二倍体棉种33个,异源四倍体棉种6个,在39个种中除4个栽培种外,其余都是野生种,广泛分布在非洲、22澳大利亚、亚洲、中美和南美等地,但在我国,自然界中分布的棉属野生种很少,在我国棉区无自然群体的报道.
而且一些零星的野生棉植株也大部分与栽培棉种间存在种间隔离,即种间杂种不育.
1.
2.
6育性(可育还是不育,育性高低,如果不育,说明属何种不育类型)栽培棉花大多数品种是可育的,靠种子繁殖.
本研究杀虫基因的受体材料均为正常可育.
1.
2.
7全生育期全生育期121天.
1.
2.
8在自然界中生存繁殖的竞争能力,如越冬性、越夏性及抗逆性等我国栽培棉花为一年生植物,在我国大部分地区可正常开花结实,由于棉花是高度驯化的植物,因此在自然界中竞争力不强.
有人指出棉花中的棉酚是一种抵抗逆境的防御机制,但棉花一般缺乏对严重虫灾的防御能力.
一般情况下,难以越冬(除海南外).
1.
3受体植物的生态环境1.
3.
1在国内的地理分布和自然环境我国植棉地区辽阔,东起辽河流域及长江三角洲,西至塔里木盆地西缘,南至海南岛三亚市,北抵玛纳斯河流域,除青海、西藏高原,黑龙江、吉林两省受热量条件限制,不能植棉外,棉花种植遍及全国25个省、市、自治区.
在北纬18-46°,东经76-124°之间,共划分为五大棉区:华南、长江流域(南部棉区)、黄河流域、北部(特早23熟)和西北内陆棉区.
南方棉区无霜期较长,温度较高,雨量较多,实行棉花和冬作物一年两熟栽培,北方棉区,无霜期较短,温度较低,棉花以一年一熟为主.
所处自然环境属农业生态系统(农田).
1.
3.
2生长发育所要求的生态环境条件,包括自然条件和栽培条件的改变对其地理分布区域和范围影响的可能性棉花是原产于亚热带的多年生植物,后来引种到温带经长期人工选择和培育,才逐渐演变成一年生作物,但它仍保留了无限生长,喜温喜光等特点.
其生长发育最适应温度为25-30℃,种子发芽需10.
5-12℃.
中熟品种从播种到吐絮需大于10℃以上活动积温3200-3400℃,特早熟品种为2900-3100℃.
棉花的光补偿点比一般的作物都高,为100-200勒克斯.
光饱和点为7-8万勒克斯,属于短日照作物.
如果自然条件发生较大的变化,变成适合或不适合棉花生长,会对棉花的地理分布产生影响.
但通常条件下发生这种较大变化的可能性不大.
栽培措施的改变对其地理分布区域和范围也可以产生影响,如育苗移栽、覆膜等栽培技术的采用可扩大其地理分布区域.
1.
3.
3是否为生态环境中的组成部分是.
1.
3.
4与生态环境中其他植物的生态关系,包括生态环境的改变对这种(些)关系的影响以及是否会因此产生或增加对人类健康或生态环境的不利影响棉花的发源地不在我国,在我国也没有其相关物种自然群落的报道,因此,除生存竞争外(阳光、水肥等),棉花在生态环境中与其他24植物没有明显的生态关系,不可能产生或增加对人类健康或生态环境的不利影响.
1.
3.
5与生态系统中其他生物(动物和微生物)的生态关系,包括生态环境的改变对这种(些)关系的影响以及是否会因此产生或增加对人类健康或生态环境的不利影响在生态系统中,棉花是一些昆虫(棉田害虫)的一种取食对象,也是植物病毒(菌)的宿主.
也就是棉花生产存在的病、虫害问题.
生态环境的改变对棉花害虫及病菌(毒)与棉花的关系或产生一些变化,如害虫(病菌)种类的消长变化,这种正常的波动只可能对棉花的生产产生影响,不可能产生或增加对人类健康或生态环境的不利影响.
1.
3.
6对生态环境的影响和潜在的危险程度棉花对生态环境无不利影响,尚未发现潜在的危险.
1.
3.
7涉及到国内非通常种植的物种时,应描述该植物的自然环境和有关其天然捕食者、寄生物、竞争物和共生物的资料不涉及.
1.
4受体植物的遗传变异1.
4.
1遗传稳定性棉花栽培种经过几千年的长期驯化和选育,具有遗传稳定的特性.
1.
4.
2是否有发生遗传变异而对人类健康或生态环境产生不利影响的资料无.
251.
4.
3在自然条件下与其他植物种属进行遗传物质交换的可能性.
在我国,自然界中分布的棉属野生种很少,在我国棉区无自然群体的报道.
而且一些零星的野生棉植株也大部分与栽培棉种间存在种间隔离,即种间杂种不育.
因此,在自然条件下与其他植物种属进行遗传物质交换的可能性很小.
1.
4.
4在自然条件下与其他生物(例如微生物)进行遗传物质交换的可能性未见在自然条件下棉花与其他生物发生遗传物质交换的报道,这种可能性很小.
1.
5受体植物的监测方法和监测可能性棉花遗传稳定,植株较高大,易于发现和识别,便于监测.
1.
6受体植物的其他资料无.
1.
7根据上述评价,参照本办法有关标准划分受体植物的安全等级综上所述,棉花作为一种高度驯化的农作物,尽管棉酚对人畜有毒害,但几千年的栽培历史证明,合理利用棉花及其产品对人畜不会造成任何危害,也不具有转变成杂草的可能性,其在自然界中的生长、繁殖,受到人类的控制,不能形成群落,无生态危害性.
棉花野生种在我国分布极少以及栽培种与野生种之间的种间隔离防止了棉花基因通过渐渗杂交传递给杂草.
参照有关标准,所用受体棉花应属于安全等级Ⅰ的植物.
2.
基因操作的安全性评价2.
1转基因植物中引入或修饰性状特征的叙述26本研究中目的基因(B.
t.
)的表达产物杀虫晶体蛋白,在昆虫中肠道的碱性环境下可被分解并释放出毒性肽分子,可特异性的作用于昆虫中肠道内上皮细胞的纹缘膜,使细胞穿孔,破坏其渗透平衡,甚至引起细胞裂解,因而可特异性的毒杀鳞翅目害虫(包括棉铃虫).
B.
t制剂作为一种生物杀虫剂应用已经有几十年的历史了,但由于B.
t制剂存在易受阳光照射分解,易被雨水冲刷流失等缺点,因而影响了这种生物杀虫剂的使用效果,1987年,B.
t基因被首次转入番茄,并证明了转基因番茄植株具有抗虫性(Fischoff等1987).
此后,抗虫基因工程的研究便愈来愈受到人们的重视.
本项研究将人工合成的适合于在植物体内表达的B.
t基因转入棉花中,使之在棉花植株中表达产生杀虫蛋白,可有效地减少棉铃虫对抗虫棉的危害.
同时,引入了NptII选择标记基因和Gus报告基因,可表达的性状是对卡那霉素产生抗性,以及可分解GUS底物产生蓝色的特性.
2.
2实际插入或删除序列的以下资料2.
2.
1插入序列的大小和结构,确定其特性的分析方法本研究用于棉花导入的质粒全长16.
2kb,插入序列中包含3.
2kb的Bt杀虫基因表达盒、1.
4kb的NptII基因表达盒以及2.
9kb的Gus基因表达盒.
载体中其他结构序列也部分插入.
通过设计各插入片段的特异性引物,用PCR方法可检测插入序列在棉花基因组中的整合.
通过抗虫生物学测试,可检测Bt杀虫基因的表达特性;通过卡那霉素筛选,可检测NptII标记基因的表达特性;通过Gus反应测试,可检测Gus报告基因的表达特性.
2.
2.
2删除区域的大小和功能27未对棉花自身序列进行删除操作.
2.
2.
3目的基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列目的基因编码区全长1824bp,编码608个氨基酸.
其核苷码序列如下:ATGGACTGCAGGCCATACAACTGCTTGAGTAACCCAGAAGTTGAAGTACTTGGTGGAGAA60CGCATTGAAACCGGTTACACTCCCATCGACATCTCCTTGTCCTTGACACAGTTTCTGCTC120AGCGAGTTCGTGCCAGGTGCTGGGTTCGTTCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATC180TTTGGTCCATCTCAATGGGATGCATTCCTGGTGCAAATTGAGCAGTTGATCAACCAGAGG240ATCGAAGAGTTCGCCAGGAACCAGGCCATCTCTAGGTTGGAAGGATTGAGCAATCTCTAC300CAAATCTATGCAGAGAGCTTCAGAGAGTGGGAAGCCGATCCTACTAACCCAGCTCTCCGC360GAGGAAATGCGTATTCAATTCAACGACATGAACAGCGCCTTGACCACAGCTATCCCATTG420TTCGCAGTCCAGAACTACCAAGTTCCTCTCTTGTCCGTGTACGTTCAAGCAGCTAATCTT480CACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGGATTCGATGCTGCA540ACCATCAATAGCCGTTACAACGACCTTACTAGGCTGATTGGAAACTACACCGACCACGCT600GTTCGTTGGTACAACACTGGCTTGGAGCGTGTCTGGGGTCCTGATTCTAGAGATTGGATT660AGATACAACCAGTTCAGGAGAGAATTGACCCTCACAGTTTTGGACATTGTGTCTCTCTTC720CCGAACTATGACTCCAGAACCTACCCTATCCGTACAGTGTCCCAACTTACCAGAGAAATC780TATACTAACCCAGTTCTTGAGAACTTCGACGGTAGCTTCCGTGGTTCTGCCCAAGGTATC840GAAGGCTCCATCAGGAGCCCACACTTGATGGACATCTTGAACAGCATAACTATCTACACC900GATGCTCACAGAGGAGAGTATTACTGGTCTGGACACCAGATCATGGCCTCTCCAGTTGGA960TTCAGCGGGCCCGAGTTTACCTTTCCTCTCTATGGAACTATGGGAAACGCCGCTCCACAA1020CAACGTATCGTTGCTCAACTAGGTCAGGGTGTCTACAGAACCTTGTCTTCCACCTTGTAC1080AGAAGACCCTTCAATATCGGTATCAACAACCAGCAACTTTCCGTTCTTGACGGAACAGAG1140TTCGCCTATGGAACCTCTTCTAACTTGCCCTCCGCTGTTTACAGAAAGAGCGGAACCGTT1200GATTCCTTGGACGAAATCCCACCACAGAACAACAATGTGCCACCCAGGCAAGGATTCTCC1260CACAGGTTGAGCCACGTGTCCATGTTCCGTTCCGGATTCAGCAACAGTTCCGTGAGCATC1320ATCAGGGCTCCTATGTTCTCTTGGATACACCGTAGTGCTGAGTTCAACAACATCATCGCA1380TCCGATAGTATTACTCAAATCCCTGCAGTGAAGGGAAACTTTCTCTTCAACGGTTCTGTC1440ATTTCAGGACCAGGATTCACTGGTGGAGACCTCGTTAGACTCAACAGCAGTGGAAACAAC1500ATTCAGAATAGGAGGTATATTGAAGTTCCAATTCACTTCCCATCCACATCTACCAGATAT1560AGAGTTCGTGTGAGGTATGCTTCTGTGACCCCTATTCACCTCAACGTTAATTGGGGTAAT1620TCATCCATCTTCTCCAATACAGTTCCAGCTACAGCTACCTCCTTGGATAATCTCCAATCC1680AGCGATTTCGGTTACTTTGAAAGTGCCAATGCTTTTACATCTTCACTCGGTAACATCGTG1740GGTGTTAGAAACTTTAGTGGGACTGCTGGAGTGATTATCGACAGATTCGAGTTCATTCCA1800GTTACTGCAACACTCGAGGCTGAA1824编码杀虫蛋白质的608个氨基酸序列如下:MetAspCysArgProTyrAsnCysLeuSerAsnProGluValGluValLeuGlyGlyGluArgIleGluThrGlyTyrThrProIleAspIleSerLeuSerLeuThrGlnPheLeuLeuSerGluPheValProGlyAlaGlyPheValLeuGlyLeuValAspIleIleTrpGlyIle28PheGlyProSerGlnTrpAspAlaPheLeuValGlnIleGluGlnLeuIleAsnGlnArgIleGluGluPheAlaArgAsnGlnAlaIleSerArgLeuGluGlyLeuSerAsnLeuTyrGlnIleTyrAlaGluSerPheArgGluTrpGluAlaAspProThrAsnProAlaLeuArgGluGluMetArgIleGlnPheAsnAspMetAsnSerAlaLeuThrThrAlaIleProLeuPheAlaValGlnAsnTyrGlnValProLeuLeuSerValTyrValGlnAlaAlaAsnLeuAsnLeuSerValLeuArgAspValSerValPheGlyGlnArgTrpGlyPheAspAlaAlaThrIleAsnSerArgTyrAsnAspLeuTyrArgLeuIleGlyAsnTyrThrAspHisAlaValArgTrpTyrAsnThrGlyLeuGluArgValTrpGlyProAspSerArgAspTrpIleArgTyrAsnGlnPheArgArgGluLeuThrLeuThrValLeuAspIleValSerLeuPheProAsnTyrAspSerArgThrTyrProIleArgThrValSerGlnLeuThrArgGluIleTyrThrAsnProValLeuGluAsnPheAspGlySerPheArgGlySerAlaGlnGlyIleGluGlySerIleArgSerProHisLeuMetAspIleLeuAsnSerIleThrIleTyrThrAspAlaHisArgGlyGluTyrTyrTrpSerGlyHisGlnIleMetAlaSerProValGlyPheSerGlyProGluPheThrPheProLeuTyrGlyThrMetGlyAsnAlaAlaProGlnGlnArgIleValAlaGlnLeuGlyGlnGlyValTyrArgThrLeuSerSerThrLeuTyrArgArgProPheAsnIleGlyIleAsnAsnGlnGlnLeuSerValLeuAspGlyThrGluPheAlaTyrGlyThrSerSerAsnLeuProSerAlaValTyrArgLysSerGlyThrValAspSerLeuAspGluIleProProGlnAsnAsnAsnValProProArgGlnGlyPheSerHisArgLeuSerHisValSerMetPheArgSerGlyPheSerAsnSerSerValSerIleIleArgAlaProMetPheSerTrpIleHisArgSerAlaGluPheAsnAsnIleIleAlaSerAspSerIleThrGlnIleProAlaValLysGlyAsnPheLeuPheAsnGlySerValIleSerGlyProGlyPheThrGlyGlyAspLeuValArgLeuAsnSerSerGlyGlyAsnIleGlnAsnArgArgTyrIleGluValProIleHisPheProSerThrSerThrArgTyrArgValArgValArgTyrAlaSerValThrProIleHisLeuAsnValAsnTrpGlyAsnSerSerIlePheSerAsnThrValProAlaThrAlaThrSerLeuAspAsnLeuGlnSerSerAspPheGlyTyrPheGluSerAlaAsnAlaPheThrSerSerLeuGlyAsnIleValGlyValArgAsnPheSerGlyThrThrGlyValIleIleAspArgPheGluPheIleProValThrAlaThrLeuGluAlaGlu2.
2.
4插入序列在植物细胞中的定位(是否整合到染色体、叶绿体、线粒体,或以非整合形式存在)及其确定方法插入序列在棉花细胞中的定位为染色体上.
可通过对棉花基因组DNA进行Southern杂交或通过PCR检测证明.
2.
2.
5插入序列的拷贝数Southern杂交检测表明,通过花粉管通道导入的转基因棉花植株插入序列一般为多拷贝整合.
所用转基因亲本GK12经Southern杂交分析表明含有3个插入序列拷贝.
2.
3目的基因与载体构建的图谱,载体的名称、来源、结构、特29性和安全性,包括载体是否有致病性或可能演变为有致病性B.
t基因克隆所用载体为pBI121.
1.
它是植物基因工程中常用的载体.
该质粒是在pBI101.
1的基础上,在GUS基因前增加了一个35S启动子.
pBI101.
1来源于农杆菌双元质粒pBIN19(Jefforson,efal,1987),其复制起始子为低拷贝的RK2,并带有在细菌及植物中均可表达的卡那霉素抗性基因以及GUS报告基因.
这一载体在大肠杆菌和农杆菌以及植物中是安全的,没有致病性,也不会演变为有致病性.
本实验中所用高效表达载体中目的基因及标记基因图谱如下:2.
4载体中插入区域各片段的资料2.
4.
1启动子和终止子的大小、功能及其供体生物名称在表达载体中,B.
t基因所用的启动子来源于花椰菜病毒(CaMv),30为组成型表达的35S启动子.
本研究所用启动子是利用DNA重组技术对质粒pBI121上的35S启动子进行修饰,用PCR技术复制了其约380bp的增强子,并置换了其5'端的约390bp序列而获得的.
因此所用启动子含有790个碱基对,带有2个增强子.
终止子为NOS终止子(NT),由252个碱基对组成.
来源于土壤农杆菌Ti质粒中脂肪碱合成酶基因的终止序列,可终止转录.
此外,NptII基因由Nos启动子驱动,约360个碱基对,也是一种组成型表达的启动子.
Gus基因由未经改变的35S启动子驱动,这两个基因均由Nos终止子终止转录.
2.
4.
2标记基因和报告基因的大小、功能及其供体生物名称标记基因为新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ),编码区全长795碱基对,来源于一种大肠杆菌(E.
Coli),在植物中未发现过该基因.
该基因编码新霉素磷酸转移酶,可以使卡那霉素失去活性,从而使转基因植株产生卡那霉素抗性.
所用报告基因为GUS基因,基因编码区大小为1808碱基对,也来源于大肠杆菌(E.
Coli),它编码β-葡糖苷酸酶,可以使GUS底物(β-葡糖苷酸)分解,产生兰色反应.
2.
4.
3其它表达调控序列的名称及其来源(如人工合成或供体生物名称)对抗虫目的基因的表达进行调控的其它表达调控序列还包括5'端衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因编码区的翻译增强序列序列、Kozak序列.
序列由68bp组成,富集TTAAC序列,5'端有一个UAUUUUUACAACAAT序列以及4个UUAC序列,这些序列在蛋白质合成的翻译过程中构成核糖体和rRNA结合位点.
促进外源基因在31植物细胞内翻译过程的Kozak序列是位于起始密码子ATG前的AACA序列,均由人工合成.
3'端还包括可防止移码通读的多联终止序列、正确加工和切割序列以及PolyA序列,均为人工合成获得.
2.
5转基因方法本研究转基因棉花所用方法为花粉管通道法.
将带有目的基因的表达载体质粒提纯(应用氯化铯密度梯度离心),用于转基因注射.
具体操作方法是:在棉花花开并完成受粉后的花粉管萌发时期,用微量注射器将10ul纯化后的DNA(0.
2ug/ul)注射到受精后的子房内,待种子成熟后,第二年进行鉴定,筛选出转基因棉花植株.
通过常规杂交将杀虫基因转入GK12中.
2.
6插入序列表达的资料2.
6.
1插入序列表达的器官和组织,如根、茎、叶、花、果实、种子等抗虫基因可在棉花的根、茎、叶、花、棉蕾、棉铃、种子中均有不同程度的表达.
2.
6.
2插入序列的表达量及其分析方法检测结果表明,抗虫基因的表达量随棉花的生长发育而变化.
一般在生长季前期表达量较高,以后开始下降(在花瓣中例外,一直较高).
在不同器官中表达量也有所不同,一般叶和花瓣中最高,在6月底可达到1ug/g鲜重(此结果为ELISA检测结果),其次为棉铃、棉蕾,花蕊中最低(根、茎未测).
ELISA检测杀虫蛋白表达量的分析方法:苏云金杆菌晶体蛋白的提取:将冷冻Bt菌种HD-1在30℃复苏3248小时,然后将菌液涂布在培养基平皿上,30℃保温,约培养60小时,至芽孢和晶体分离.
收集菌,超声波破碎,离心.
沉淀溶解于蒸馏水,充分搅拌后去掉上层泡沫.
将去掉泡沫的悬浮液倒入分液漏斗,加入1%硫酸钠水溶液与四氯化碳(悬浮液:1%硫酸钠水溶液:四氯化碳=7:6:7),剧烈振荡15min,室温静置过夜,取上层水相,12,500g离心15分钟,沉淀物即晶体蛋白.
对晶体蛋白进行SDS-PAGE分析可知:从Bt野生菌HD-1中提取的杀虫蛋白主要成分是130KD左右的蛋白,少量为65KD左右.
经Trysin消化后,剩下的抗酶解多肽分子量约60KD.
晶体蛋白抗血清的制备:用制备的晶体蛋白作为抗原,常规免疫年龄在6个月、体重在3kg左右的雌性健康青紫蓝兔.
兔颈动脉取血,放4℃冰箱过夜,待血清充分析出,取血清,加入万分之二叠氮钠(NaN3)防腐,分装后放入-20℃冰箱长期保存.
免疫扩散实验(1.
5%琼脂糖),测得抗血清效价为1:64.
ELISA方法的建立:取棉花样品0.
4克,加1.
0mLCBS缓冲液研磨;8000rpm离心5min,取上清,1mL提取液加25mgPVP;8000rpm离心5min,取上清50μl,包被酶标板,37℃保温2.
5h.
用CK棉籽粉液吸附一抗,4℃保存2.
5小时以上.
用PBST洗涤三次.
每孔加一抗稀释液150μl,37℃保温0.
5h;用PBST洗涤三次,每孔加辣根酶标记的羊抗兔稀释液150μl,37℃保温0.
5h;每孔加100μlTMB底物显色;20min后每孔加2mol/L硫酸50μl终止反应,用酶标仪在450nm测光吸收值.
由标准蛋白梯度对应的检测OD值作出回归直线;33由样品的检测OD值通过回归直线计算出样品的杀虫蛋白含量.
2.
6.
3插入序列表达的稳定性经多代选育、抗虫性跟踪鉴定,目的基因可稳定遗传并表达.
2.
7根据上述评价,参照本办法有关标准划分基因操作的安全类型根据上述评价,本遗传操作没有增加受体生物棉花的危险性,故应为类型Ⅱ,即对受体生物的安全性没有影响.
3转基因植物的安全性评价3.
1转基因植物的遗传稳定性通过植株抗虫性测试表明,目的基因在转基因棉花中以有性生殖方式传递给后代,经加代,纯合后,可以获得目的基因稳定遗传给后代的纯合体,对棉铃虫的抗性也可以稳定遗传.
3.
2转基因植物与受体或亲本植物在环境安全性方面的差异3.
2.
1生殖方式和生殖率转基因棉花为有性繁殖,生殖方式和生殖率与常规棉花没有差异.
3.
2.
2传播方式和传播能力棉花的传播方式为人工种植,自然传播能力差.
3.
2.
3休眠期栽培棉花为一年生作物,转基因棉花和常规棉花无差别.
3.
2.
4适应性转基因棉花由于具有对鳞翅目害虫的抗性,因此较常规棉花具有更好的适应性,尤其在棉铃虫发生严重的年份.
3.
2.
5生存竞争能力由于转基因棉花的抗虫特性,使之较常规棉花具有更强的生存竞34争能力.
3.
2.
6转基因植物的遗传物质向其他植物、动物和微生物发生转移的可能性在我国,自然界中分布的棉属野生种很少,在我国棉区无自然群体的报道.
而且一些零星的野生棉植株也大部分与栽培棉种间存在种间隔离,即种间杂种不育.
因此,在自然条件下与其他植物种属进行遗传物质交换的可能性很小.
未见在自然条件下棉花与其他动物、微生物发生遗传物质交换的报道,这种可能性极小.
3.
2.
7转变成杂草的可能性转基因棉花不存在成为杂草的可能性,一方面因为棉花起源于国外,在国内没有能与之杂交的野生种,另一方面目的基因不会对受体植物的生长、发育以及它性状带来明显影响.
受体植物已被驯化为一年生栽培作物,且具有上千年的栽培历史,其生产活动易于受到控制,因而不具有转化成杂草的可能性.
3.
2.
8抗病虫转基因植物对靶标生物及非靶标生物的影响,包括对环境中有益和有害生物的影响转基因棉花对棉铃虫等鳞翅目害虫具有显著的抗性,因而抗虫棉田不需大量喷洒农药防虫.
因此,与非转基因棉花相比,转基因棉田一些有益昆虫的数量也有所增加的同时,非鳞翅目害虫如蓟马、盲蝽象等害虫数量有上升的趋势.
须注意对这类害虫的控制.
3.
2.
9对生态环境的其他有益或有害作用在我国植棉面积较大,种植常规棉花每年用于棉田害虫防治的农药用量随棉铃虫对农药抗性的发展而越来越大.
转基因棉花的种植由35于大幅度减少了农药用量,对于保护生态环境具有重大的意义.
未发现转基因棉花对生态环境的有害作用.
3.
3转基因植物与受体或亲本植物对人类健康方面影响的差异3.
3.
1毒性转基因棉花和常规棉花在毒性方面无差别.
见转基因抗虫GK12棉籽及棉籽油的毒理学试验报告.
3.
3.
2过敏性转基因棉花和常规棉花在过敏性方面无差别.
见转基因抗虫棉GK12棉籽及棉籽油的毒理学试验报告.
3.
3.
3抗营养因子转基因棉花和常规棉花基本无差别.
3.
3.
4营养成分转基因棉花和常规棉花基本无差别.
3.
3.
5抗生素抗性转基因棉花具有卡那霉素抗性,常规棉花不具备该特性.
3.
3.
6对人体和食品安全性的其他影响转基因棉花和常规棉花在对人体和食品安全性方面无差别.
3.
4根据上述评价,参照本办法有关标准划分转基因植物的安全等级根据以上分析,转BtCry1A杀虫基因棉花GK12除提高了棉花的抗虫能力外,对人类和其它生物(不包括鳞翅目害虫)无害,也不会破坏自然生态环境,因而属于安全等级Ⅰ.
三、转基因抗虫棉GK12毒理学试验结果1、转基因抗虫棉GK12棉籽仁/棉籽毒理学试验结果1.
1检验项目:大鼠30天喂养试验36样品名称:Bt单价抗虫棉(GK12)棉籽仁检验单位:中国疾病预防控制中心营养与食品安全所检验结果:将Bt单价抗虫棉棉籽仁按5%比例掺入饲料喂养大鼠30天,动物活动、生长未见异常,被毛浓密有光泽.
未见Bt单价抗虫棉棉籽仁对大鼠体重、食物利用率、血液学指标、血生化指标、脏体比及组织病理学观察有明显不良影响.
1.
2检验项目:雌、雄大鼠急性经口毒性试验(LD50)样品名称:单价转基因抗虫棉(GK12)棉籽检验单位:中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所检验结果:经口给药后,未见大鼠出现中毒症状及异常表现,重复试验亦得到相同结果.
雌、雄性大鼠急性经口LD50均大于15000mg/kg体重.
结论:根据《农药登记毒理学试验方法》(GB.
15670-1995),并参考《食品安全性毒理学评价程序和方法》、(GB.
15193.
1-15193.
19-94),单价转基因抗虫棉(GK12)棉籽样品的大鼠急性经口毒性属于无毒.
1.
3检验项目:雌、雄大鼠急性经皮毒性试验(LD50)样品名称:单价转基因抗虫棉(GK12)棉籽检验单位:中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所结果:经皮给药后,未见大鼠出现中毒症状及异常表现,重复实验亦得到相同结果.
雌、雄性大鼠急性经皮LD50均大于5000mg/kg体重.
37结论:根据《农药登记毒理学试验方法》(GB.
15670-1995),并参考《化妆品安全性评价程序和方法》(GB.
7919-87),单价转基因抗虫棉(GK12)棉籽样品的大鼠急性经皮毒性属于实际无毒.
1.
4检验项目:家兔皮肤刺激试验样品名称:单价转基因抗虫棉(GK12)棉籽检验单位:中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所结果:去除受试物后1、24、48和72小时,4只家兔给药侧均未出现红斑和水肿等皮肤刺激反应,皮肤刺激反应评分为0分.
对照侧无异常反应.
结论:根据《农药登记毒理学试验方法》(GB.
15670-1995)中的"皮肤刺激强度分级"标准,单价转基因抗虫棉(GK12)棉籽样品对皮肤刺激属于无刺激性.
1.
5检验项目:家兔眼刺激试验样品名称:单价转基因抗虫棉(GK12)棉籽检验单位:中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所结果:滴入受试物后1、24、48和72小时,4只家兔给药侧均未出现角膜、结膜的刺激反应,眼刺激积分平均为0分.
对照侧无异常反应.
结论:根据《农药登记毒理学试验方法》(GB.
15670-1995)中的"眼刺激性分级标准"标准,单价转基因抗虫棉(GK12)棉籽样品对眼无刺激性.
2、转基因抗虫棉GK12棉籽油毒理学试验结果382.
1检验项目:雌、雄大鼠急性经口毒性试验(LD50)样品名称:单价转基因抗虫棉(GK12)棉籽油检验单位:中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所结果:经口给药后,未见大鼠出现中毒症状及异常表现,重复实验亦得到相同结果.
雌、雄性大鼠急性经口LD50均大于15000mg/kg体重.
结论:根据《农药登记毒理学试验方法》(GB.
15670-1995),并参考《食品安全性毒理学评价程序和方法》、(GB.
15193.
1-15193.
19-94),单价转基因抗虫棉(GK12)棉籽油样品的大鼠急性经口毒性属于无毒.
2.
2检验项目:雌、雄大鼠急性经皮毒性试验(LD50)样品名称:单价转基因抗虫棉(GK12)棉籽油检验单位:中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所结果:经皮给药后,未见大鼠出现中毒症状及异常表现,重复实验亦得到相同结果.
雌、雄性大鼠急性经皮LD50均大于5000mg/kg体重.
结论:根据《农药登记毒理学试验方法》(GB.
15670-1995),并参考《化妆品安全性评价程序和方法》、(GB.
7919-87),单价转基因抗虫棉(GK12)棉籽油样品的大鼠急性经皮毒性属于实际无毒.
2.
3检验项目:家兔皮肤刺激试验样品名称:单价转基因抗虫棉(GK12)棉籽油检验单位:中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所39结果:去除受试物后1、24、48和72小时,4只家兔给药侧均未出现红斑和水肿等皮肤刺激反应,皮肤刺激反应评分为0分.
对照侧无异常反应.
结论:根据《农药登记毒理学试验方法》(GB.
15670-1995)中的"皮肤刺激强度分级"标准,单价转基因抗虫棉(GK12)棉籽油样品对皮肤刺激属于无刺激性.
2.
4检验项目:家兔眼刺激试验样品名称:单价转基因抗虫棉(GK12)棉籽油检验单位:中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所结果:滴入受试物后1、24、48和72小时,4只家兔给药侧均未出现角膜、结膜的刺激反应,眼刺激积分平均为0分.
对照侧无异常反应.
结论:根据《农药登记毒理学试验方法》(GB.
15670-1995)中的"眼刺激性分级"标准,单价转基因抗虫棉(GK12)棉籽油样品对眼