定量pcr简述定量PCR的原理和过程

定量pcr 时间:2021-06-16 阅读:()

求半定量PCR的详细步骤要详细到每一步喔

研究人员常常需要检测特定基因的表达水平，检测的手段很多，主要有Northern, 半定量RT-PCR, 荧光定量PCR(real time PCR),基因芯片的手段。

很难用几行字来说清楚这些技术的优缺点。

Northern方式比较直观，但是难以批量进行，劳动量较大；半定量RT-PCR,被一些学员所推崇，因为很多实验室都可以做，但是半定量RT-PCR的关键要保证所有样品的可比性非常困难，内参需要与待检测基因同管扩增，但是由于内参基因表达水平太高，常常抑制检测基因的扩增，常常是分开扩，都可以扩增出来，混在一起就没有了，所以有时不能反映基因表达的实际情况。

目的基因和内参基因分开扩增的所谓半定量RT-PCR，没有什么学术意义。

荧光定量PCR，在学术界和临床诊断都被广泛采用，该技术能比较真实反映基因的表达水平，实时监控PCR扩增，数据处理自动化和数字化。

荧光定量PCR需要采用具有5-3外切酶活性的Taq酶扩增，合成一对普通引物和一条荧光双标记的Taq-Man探针。

要准雀体现表达水平，半定量RT-PCR, 荧光定量PCR扩增的循环数比常规少，扩增产物一般都要求处在线性区，如果扩增过程已到达平台区，扩增产物就不能反映基因拷贝数的高低。

基因芯片的基本原理和Northern 基本相同，类似于点杂交，都是采用杂交原理，差别是基因芯片一般采用荧光探针，可以同时比较很多样品，可以批量处理和自动化。

不足之处是检测设备费用高，假阳性的比较高，需要其他方式予以验证。

做定量PCR为什么要提RNA而不是DNA

一般作定量PCR的目的是看不同时间空间某个基因“活动”，一般而言就是在一个内参下看某种mRNA的丰度，可以直观的检测出一个基因在感兴趣的部位有无表达，表达的强度，要是抽提DNA则不能检测，因为DNA在所有的组织中都存在，是不能反映所研究的问题的，所以做定量PCR要提RNA 也可以用DNA，一般来做基因拷贝数的估算

实时定量PCR基本原理如何？

实时PCR（real—time polymerase chain reaction）又称荧光定量PCR或TaqMan PCR，是美国PE公司（Perkin Elmer）于1995年研制出的一种新的核酸定量技术。

该技术在常规PCR基础上运用荧光能量传递（fluorescence resonance energy transfer，FRET）技术，加入荧光标记探针，巧妙地把核算扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助于荧光信号来检测PCR产物。

一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。

另外由于CT值是一个完全客观的参数，CT值越小，模版DNA的起始拷贝数越小。

因此，利用CT值确定DNA拷贝数实时PCR方法比普通终点定量方法更加准确。

实时荧光定量PCR和定量PCR有什么区别

完全两个不同的概念,梯度PCR是指你的PCR仪在设置的时候可以同一时间不同位置设置一个从高到低的温度梯度,以便在不知道退火温度的情况下选择一个最适宜的退火温度.二实时荧光定量PCR是通过再PCR过程中掺入荧光染料或释放荧光基团,从而对模板进行相对定量或绝对定量的实验,在实时荧光定量PCR时也可以设置梯度,总的来说实时荧光定量PCR是一种实验方法,而梯度PCR是一种实验手段

荧光定量PCR是什么东东？

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。