浓度测测我的网速

图3反应时间对酯化率的影响Fig.
3Theeffectsofreactiontimeontheesterfecationrate由图3可知,随着时间的增长酯化率在增大,但当时间到达24h酯化率的增大的幅度不大,综合能耗等影响因素选择24h为最佳条件.
2.
5溶剂量对酯化率的影响溶剂量也是影响反应转化率的一个重要因素,反应体系中加入溶剂后,反应底物的浓度降低,与酶接触的表面积增大.
不同溶剂量对该反应的影响见表3.
表3甘油和正己烷的体积比对酯化率的影响Table3TheeffectsofthevolumeofglycerolandN-hexaneontheesterfeca2tionrateV(甘油)∶V(正己烷)1∶2.
51∶21∶1.
51∶11∶0.
5酯化率(%)88.
589.
190.
892.
389.
7由表3可知,过多加入正己烷将稀释反应物的浓度,对反应不利.
因此,选择甘油和溶剂的体积比1∶1为宜.
2.
6脂肪酶用量对酯化率的影响酶量的不同直接影响着酯化反应速度和酯化率.
在存在组够量反应底物的情况下,改变酶的用量测定反应酯化率.
结果见图4.
图4脂肪酶的用量对酯化率的影响Fig.
4Theeffectsoftheamountsusedoflipaseontheesterfecationrate由图4可知,当脂肪酶用量0.
25%增加至2.
5%时酯化率从22%增至95%.
但是,酶用量从1%以后再增加,酯化率不再有明显提高.
2.
7脂肪酶的重复使用性能试验固定化脂肪酶在有机溶剂体系中不但具要较好的催化活性,而且具要良好的稳定性,易于回收和可以重复使用多次.
该反应中经过6次重复使用催化剂,前3次反应酯化率均可以达到85%以上,展示出有机溶剂体系酶催化反应在工业化生产中的巨大潜力.
3讨论脂肪酸甘油酯是食品乳化中用量最大的品种,需求量逐年递增.
目前脂肪酸甘油酯的合成通常采用化学法如用硫酸催化剂、金属氧化物及盐类催化剂、固体酸催化剂、另外有杂多酸催化剂等;虽然催化效率较高,但对设备腐蚀严重、副反应多、后处理复杂、环境污染严重.
近年来,最为关注的是生物酶催化剂,可合成化学法难以合成的物质,其催化反应条件温和,能耗低;且脂肪酶产生菌的选育、其分离纯化及固定化技术的发展,已有了工业化生产的商品脂肪酶制剂.
这为油脂工业全面引入脂肪酶生物技术提供了条件.
可以预见,脂肪酶将如同蛋白酶、淀粉酶在食品工业中的作用一样得到油脂工业的普遍重视和广泛应用.
亚麻酸甘油酯易于消化吸收,且比较稳定,是较为理想的食品添加剂,具有应用范围广的特点.
本研究利用微生物脂肪酶催化技术,在温和的条件下催化合成亚麻酸甘油酯.
考察了其合成工艺条件和影响酯化率的主要因素.
较佳工艺条件为:以正己烷为溶剂、酯化温度60℃、酸醇摩尔比1∶2.
5条件下、反应24h,亚麻酸甘油酯化率为90%以上.
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银离子对辣根过氧化物酶的影响刘成1,韩宏岩1,张颖1,许维岸23(1.
山东农业大学生命科学学院,江苏泰安271018;2.
苏州大学生命科学学院,江苏苏州215006)摘要:实验研究Ag+对HRP的影响对检测银的污染有重要意义.
以ABTS[2,2-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]和H2O2为底物,在pH值5.
0的条件下,用分光光度法考察了Ag+存在下的辣根过氧化物酶催化氧化反应.
Ag+对辣根过氧化物酶的催化活性显示出抑制作用,并进一步分别探讨了对两种底物的抑制类型和对酶结构的影响.
结果表明Ag+对底物H2O2而言,对酶的抑制效应属于反竞争性抑制类型,抑制常数Ki=14.
83mmolΠL;对底物ABTS而言,对酶的抑制效应属于非竞争性抑制,抑制常数Ki=16.
139mmolΠL.
不同浓度Ag+分别与酶作用后,测定酶的内源荧光光谱.
光谱结果表明Ag+影响酶活性的同时也影响酶的构象.
关键词:辣根过氧化物酶;银离子;抑制中图分类号:Q554+.
6文献标识码:A文章编号:1004-311X(2006)04-0049-04EffectsofAg+ontheCatalyticOxidationbyHRP第16卷第4期:492006年8月生物技术BIOTECHNOLOGYVol116,No14:49Aug12006http://www.
paper.
edu.
cnLIUCheng1,HANHong-yan1,ZHANGYing1,XUWei-an23(1.
ShandongAgricultureUniversity,Taian271018;2.
SuzhongUniversity,Suzhou215006,China)Abstract:StudyingtheeffectsofAg+onHRPhastheimportantmeaningtotestsilverpollution.
TheeffectsofAg+ontheoxidationofABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobinesulfonate-6)]catalyzedbyHRPwerestudiedspectrophotometrylyunderconditionofpH5.
0.
There2sultsshowthatAg+hasobviousinhibitionontheHRPactivity.
AsfarasH2O2,thenatureofinhibitionisuncompetitivetype,Ki=14.
83mmolΠL.
AsfarasABTS,thenatureofinhibitionisnoncompetitivetype,Ki=16.
139mmolΠL.
Surveyingfluorescence,Ag+influencedtheconformationofHRP.
Keywords:horseradishperoxidase;Silverion;inhibition收稿日期:2005-10-28;修回日期:2006-02-16作者简介:刘成(1982-),男,硕士,研究方向:微生物发酵;3通讯作者:许维岸,E-mail:frank@sdau.
edu.
cn.
辣根(horseradish)是一种长年生香草,它的根含有一种含量丰富的过氧化物酶.
虽然这种酶常用"辣根过氧化物酶"(horseradishperoxidase,HRP)这个词来形容,但其实辣根的根部含有很多此酶的同工酶,而"辣根过氧化物酶"则是这些同工酶的总称,其中以辣根过氧化物酶同工酶C(HRPC)的含量最为丰富.
HRPC是生化中研究过氧化物酶的模型酶,属于含血红素辅基的酶,其结构的维持和活性的表现需要金属离子.
由于它广泛应用于医学诊断技术并且具有许多潜在的医疗应用前景,所以它也是过氧化物酶超家族中研究的最为透彻的酶.
金属离子对HRP的影响有过一些研究,如镉、镧、钙、汞、钴、镍等.
在国外GuilbaultGG利用无机离子对HRP的抑制作用,测定了Cd2+、Co2+和Cu2+[1],Skekhovtsova小组多年来一直致力于HRP法测定环境毒物的研究,利用对固定化酶催化体系的抑制作用,可测定低至10ngΠL的微量Hg2+,并将其做成试纸,以便于推广使用[2,3].
另外,近年研究成功的化学发光法测定Cu2+[4]和安培法测Mn2+[5],也扩展了HRP法测定金属离子的应用.
国内吴田平、夏炳乐等分别测定了Ca2+、La3+[6,7],但是Ag+对HRP的作用国内还未见报道.
含银离子的废水在世界绝大多数地方被定义为"危险废水",污水处理厂对此处理工作存在一定难度,经常被小心地管理和控制.
因为银离子是一种强杀菌剂,若废水中的银离子浓度过高,将会影响污水处理厂生物处理法的效果.
实验研究银离子对HRP的影响对检测银的污染有重要意义.
1材料和方法1.
1材料辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)RZ≥3.
0,购自美国Amresco.
根据HRP在波长403nm处摩尔吸光系数为102mmol·L-1cm-1测定其浓度.
ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobinesulfonate-6)]购自于美国SigmaChemicalCo.
.
H2O2、AgNO3和其他试剂均为国产分析纯.
H2O2的最终反应浓度为2.
5mmolΠL,用双蒸水稀释,置于冰箱内保存.
所有其他试剂均以无离子双重蒸馏水配置.
1.
2酶活性测定方法用ABTS法测定HRP的活性.
在25℃下,将10μl0.
01μmolΠL左右的酶液加入1ml底物溶液内,通过405nm处光吸收的变化斜率得到其活力.
底物溶液为1mmolΠL的ABTS,2.
5mmolΠL的H2O2,50mmolΠL柠檬酸钠缓冲溶液,PH=5.
0.
1.
2.
1Ag+与HRP的作用时间对酶活力的影响将Ag+加入50mmolΠL柠檬酸钠缓冲溶液,PH5.
0的缓冲溶液中,25℃水浴预热5min后,向此体系中加入一定量的HRP,当Ag+与HRP在25℃作用一定时间后,取反应体系中10μl酶液,按照正常的酶活性测试方法测定酶的剩余活力.
1.
2.
2不同浓度的Ag+对HRP的作用将不同浓度的Ag离子分别与浓度为3.
3nmolΠL的酶于25℃水浴保温90min,然后按照正常的酶活性测试方法测定酶的剩余活力.
1.
2.
3Ag+对酶的抑制动力学含不同Ag+浓度的测活体系中,固定一种底物的浓度,并使其浓度达到饱和,改变另一种底物浓度,测定酶促反应初速度,以Linweaver-Burk双倒数做图法求其抑制常数Ki值.
1.
3荧光光谱学测定HRP的内源荧光光谱在HitachiRF-5301PC荧光分光光度计上进行.
不同浓度的银离子于50mmolΠL,PH5.
0柠檬酸钠缓冲溶液中与HRP作用所需时间后,进行荧光发射光谱扫描.
激发波长为280nm.
2结果与分析2.
1Ag+对HRP活力的影响2.
1.
1Ag+对HRP的作用时间对酶活力的影响分别以0mmolΠL、10mmolΠL、20mmolΠL、30mmolΠL浓度的Ag+与HRP温育30min、45min、60min、90min,然后取10μl的酶液加入到测活体系中,测定酶的剩余活力.
结果见图1.
结果表明:Ag+对HRP的抑制作用在60min之前,随着温浴时间的增加,抑制作用逐渐增强,60min后增加温浴时间,酶活力变化不大,90min后酶的剩余活力不再变化,Ag+对HRP的抑制作用在90min后达到平衡.
初步断定Ag+对HRP的抑制作用存在快慢两相.
图1酶与不同浓度的Ag+作用时间对酶活力的影响2.
1.
2Ag+浓度对HRP活力的影响分别以浓度为0mmolΠL、4mmolΠL、6mmolΠL、8mmolΠL、10mmolΠL、20mmolΠL、30mmolΠL的Ag+与HRP作用90min后,测定酶的剩余活力,结果见图2.
由图可知,Ag+对HRP有抑制作用,当Ag+浓度小于10mmolΠL时,随着Ag+浓度的增加酶活力逐渐降低,酶活力变化明显.
Ag+大于10mmolΠL之后随着浓度的增大,酶活力降低不明显,酶的剩余活力表现浓度依赖性,当Ag+浓度30mmolΠL时,酶的剩余活力是52%,再增加Ag+浓度,酶的剩余活力趋于稳定.
结果说明:增加Ag+浓度可使酶活力降低,但最终不能使酶的催化活性完全丧失,仍有剩余活性,因此推断Ag+对HRP的抑制作用是可逆抑制反应.
2.
2Ag+对酶抑制作用的动力学2.
2.
1动力学常数Km与Vmax我们用Linweaver-Burk双倒数作图法求双底物酶的各动力学常数:1ΠV=KmΠVmax31Π[S]+1ΠVmax[9]按照以上的基本公式,该直线纵截距=1ΠVmax,横轴截距=-1ΠKm.
固定一种底物浓度使其饱和,改变另一种底物的浓度,分别求出酶对底物H2O2和ABTS的Vmax和Km.
05生物技术第16卷第4期固定H2O2的浓度,改变ABTS的浓度,由图3线0结果可求出该酶对底物ABTS的Vmax和Km分别是0.
379ΔA405Πs和1.
360mmolΠL.
固定ABTS的浓度,改变H2O2的浓度,由图5线0可求出该酶对底物H2O2的Vmax和Km分别是0.
229ΔA405Πs和0.
424mmolΠL.
图2不同浓度Ag+离子对酶活性的影响2.
2.
2对于底物ABTS,Ag+对酶的抑制类型固定H2O2的浓度,在测活体系中加入不同浓度的Ag+,改变ABTS的浓度,测定酶促反应的初速度,以Linweaver-Burk双倒数作图,为一组相交于横轴的直线,结果见图3.
表明对ABTS而言,Ag+对酶的抑制效应属于非竞争性抑制类型,只影响Vmax不影响Km.
非竞争性抑制作用的速度方程可表示为:1ΠV=(KmΠVmax)(1+[I]ΠKi)·1Π[S]+1ΠVmax(1+[I]ΠKi)[9],从双倒数曲线求得不同Ag+浓度下的表观最大反应速度Vmax',以1ΠVmax'对Ag+浓度作图4求得在此反应条件下Ag+对酶的抑制常数Ki=14.
83mmolΠL.
图31ΠV和1Π[ABTS]的双倒数曲线Ag+的浓度分别是:线0:0mmolΠL;线1:4mmolΠL;线2:6mmolΠL;线3:8mmolΠL.
图41ΠVmax'对Ag+浓度的关系曲线2.
2.
3对于底物H2O2,Ag+对酶的抑制类型固定ABTS的浓度并使其达到饱和,在测活体系中加入不同浓度的Ag+,改变H2O2的浓度,测定酶促反应的初速度,以Linweaver-Burk双倒数作图,为一组平行线,结果见图5.
表明对H2O2而言,Ag+对酶的抑制效应属于反竞争性抑制类型,表明Ag+只能与酶-底物络合物结合,不能与游离酶结合,既影响Km又影响Vmax.
反竞争性抑制作用的动力学方程可表示为:V=Vmax·[S]Π〔Km+(1+[I]ΠKi)·[S].
从双倒数曲线求得不同Ag+浓度下的表观最大反应速度Vmax',以不同Ag+浓度下的1ΠVmax'对Ag+浓度作图6求得变化底物H2O2浓度,Ag+对酶-底物络合物的抑制常数Kis=16.
234mmolΠL.
图51ΠV和1Π[H2O2]的双倒数曲线Ag+的浓度分别是:线0:0mmolΠL;线1:4mmolΠL;线2:6mmolΠL;线3:10mmolΠL;线4:15mmolΠL.
图61ΠVmax'和Ag+浓度的的关系曲线2.
3构象变化不同浓度的银离子于50mmolΠLpH5.
0柠檬酸钠缓冲溶液中与HRP作用90min后,进行荧光发射光谱扫描.
如图7所示.
酶经不同浓度Ag+作用后,其荧光强度随着Ag+浓度的增大逐渐下降,但是直到Ag+达到20mmolΠL时,最大发射波长也没有明显的改变.
结合Ag+浓度抑制酶活性的浓度特性,表明Ag+引起酶分子内色氨酸和酪氨酸残基的疏水微环境产生了变化,酶的构象的改变引起活性改变.
图7不同浓度Ag+作用下酶的发射荧光扫描图曲线从上至下Ag+浓度依次为:0、4、6、8、10、20mmolΠL.
3讨论3.
1HRP是双底物酶,以ABTS和H2O2为底物研究重金属离子的抑制类型尚属首次.
Ag+在小于15mmolΠL时与酶作用90min,对ABTS而言,Ag+是非竞争性抑制剂;对H2O2言,Ag+是反竞争性抑制剂.
Ag+对酶活性的影响可能是通过结合于酶活性部位影响酶的构象从而影响了酶的活力.
JacquelineKeyhani[10]等人对金属Ni2+和Cd2+进行了详细的研究,发现Ni2+和Cd2+的浓度以及与酶的作用时间将会改变抑制的类152006年8月银离子对辣根过氧化物酶的影响型.
因此当Ag+浓度大于15mmolΠL时,抑制类型又如何Ag+与酶的作用时间是否会影响抑制类型尚待进一步的研究确定.
3.
2银离子影响了HRP荧光的强度,致使结构改变,但最大波长没有发生明显的红移或蓝移.
当Ag+在大于15mmolΠL时以及Ag+与酶的作用时间超过90min后,酶的荧光发射光谱强度和最大波长是否改变,Ag+是否会引起酶的二级结构的变化,尚待进一步实验确定.
另外,在实验中发现随着金属离子溶液放置时间的延长,溶液会出现白色絮状沉淀.
此时若再进行实验,会严重影响实验结果,会使酶的活性迅速降低,因此金属离子溶液一般放置不超过3d.
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超高压对灵芝生长及其漆酶合成的影响王岁楼1,2,孙君社13,吴晓宗3(1.
中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京100083;2.
中国药科大学食品科学与安全系,江苏南京210009;3.
郑州轻工业学院食品与生物工程系,河南郑州450002)摘要:研究了超高压处理对灵芝生长及其漆酶合成的影响,试验结果表明:灵芝致死率随处理压力的增大而增加,在150MPa下处理30min获得了一株生物量和漆酶产量都大幅增加的菌株G1502,其最大生物量及酶活分别比出发菌株提高了19.
34%和282.
67%,发酵时间也缩短了1d.
关键词:超高压;灵芝;漆酶中图分类号:Q936文献标识码:A文章编号:1004-311X(2006)04-0052-03EffectofUltraHighPressureontheGrowthandLaccaseProductionofG.
lucidumKarstWANGSui-lou1,2,SUNJun-she13,WUXiao-zong3(1.
CollegeofFoodScienceandNutritionalEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083;2.
DepartmentofFoodScienceandSafety,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009;3.
DepartmentofFoodandBiologyEngineering,ZhengzhouUniversityofLightIndustry,Zhengzhou450002,China)Abstract:TheeffectofultrahighpressureonthegrowthandlaccaseproductionofG.
lucidumKarswasstudied.
Withincreasementofpressure,thedeathrateofG.
lucidumKarsincreased.
TheG1502obtainedat150MPafor30miniteshadcelldryweightandlaccaseactivityof19.
3%and282.
67%higherthanthatoftheoriginalstrain,respectively,andthefermentationtimewas1dayshorterthanthatoftheoriginalstrain.
Keywords:ultrahighpressure;G.
lucidumKarst;laccase收稿日期:2006-03-02;修回日期:2006-06-06基金项目:河南省自然科学基金项目(0411021900)作者简介:王岁楼(1961-),男,在职博士,教授,研究方向为食品生物技术,E-mail:wangsuilou@zzuli.
edu.
cn;3通讯作者.
漆酶(p-diphenol:oxygenoxidoreductase,EC1.
10.
3.
2)是一种含铜的多酚氧化酶,其作用底物广泛,能氧化多种酚和芳胺类化合物,在造纸、食品加工、废水处理、土壤净化、染料脱色等方面具有广泛的应用价值[1].
漆酶可从多种途径获取,其中最有生产前景的是微生物发酵法,但目前发酵法产量尚低,故国内外不断有人利用新方法对产漆酶菌种进行处理,希望可以提高生物量和酶产量[2].
超高压(100MPa以上压力)的生物效应已被人们所肯定[3],但迄今主要局限于食品杀菌和加工处理等方面[4].
对食品进行高压处理具有低能量输入及保护小分子稳定性和最大限度保持食品原有生鲜风味与营养成分等优势,但由于成本高、连续化生产困难,目前尚处于理论和实验室研究阶段[5].
高压会引起微生物细胞形态、细胞膜、细胞壁的变化,影响细胞内生化反应、DNA复制等[6-8],据报国外已从海洋深处筛选出了耐高压的微生物[9],国内也有人采用高压技术提高了水稻的产量[10].
本文研究了超高压处理对灵芝生长及其漆酶合成的影响.
1材料与方法1.
1材料1.
1.
1菌种灵芝(G.
lucidumKarst)G0,购自河南省农科院.
1.
1.
2培养基1.
1.
2.
1斜面培养基[6](综合马铃薯培养基):土豆200gΠL(煮沸取滤汁),葡萄糖20gΠL,KH2PO43gΠL,MgSO4·7H2O1.
5gΠL,VB10.
01gΠL,琼脂20gΠL,pH6.
0.
1.
1.
2.
2液体种子培养基:组成同上述斜面培养基,但不加琼脂,pH6.
0.
1.
1.
2.
3液体发酵培养基:葡萄糖20gΠL,大豆蛋白粉5gΠL,KH2PO43gΠL,MgSO4·7H2O1.
5gΠL,VB10.
01gΠL,pH6.
0.
1.
1.
3高压处理装置实验所用超高压装置最大容积为15L,最高压力是800MPa,传压介质是蓖麻油,传压方式为外部加压式,即油压装置推动活塞将传压介质泵入超高压容器处理室内,从而来改变处理室内的压力.
可用于固、液态物品的高压处理,与介质接触的部分用高强度不锈钢制成,加压过程、保压时间均由自动控制系统控制.
1.
1.
4包装材料菌液包装采用聚丙烯塑料袋(120*75mm),121℃灭菌30min后使用.
1.
1.
5试剂以0.
04molΠL愈创木酚作为漆酶显色剂.
1.
2实验方法第16卷第4期:522006年8月生物技术BIOTECHNOLOGYVol116,No14:52Aug12006