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·1558·ChinJModApplPharm,2016December,Vol.
33No.
12中国现代应用药学2016年12月第33卷第12期超高效液相色谱-质谱联用快速同时检测止痒类中药制剂中添加11种化学药物成分赵佳丽,欧贝丽,周燕(嘉兴市食品药品检验检测院,浙江嘉兴314050)摘要:目的建立超高效液相色谱-质谱联用方法快速检测中药制剂中添加的11种化学药物成分(马来酸氯苯那敏、氯雷他定、硝酸咪康唑、盐酸特比萘芬、酮康唑、艾司唑仑、盐酸氯丙嗪、丙酸氯倍他索、醋酸地塞米松、醋酸泼尼松和吲哚美辛).
方法采用WatersACQUITYUPLCBEHC18column(2.
1mm*100mm,1.
7m);梯度洗脱:流动相A为乙腈,流动相B为5mmol·L1乙酸铵(0.
1%甲酸)水溶液.
通过比较样品峰与对照品峰的保留时间、一级质谱和二级质谱碎片离子,确定样品中是否掺杂化学止痒药物.
结果建立的快速超高效液相串联质谱方法检测上述化学药物成分不受药物辅料干扰,各色谱峰分离良好,11种待测成分最低检出限为0.
01~0.
46ng·mL1.
结论该方法简便、灵敏度高,可快速有效地判断中药制剂中是否非法掺入上述化学药品.
关键词:止痒类中药;抗组胺药;抗真菌药;镇静安眠药;糖皮质激素类药;非甾体抗炎药;超高效液相色谱-质谱联用中图分类号:R917.
101文献标志码:B文章编号:1007-7693(2016)12-1558-05DOI:10.
13748/j.
cnki.
issn1007-7693.
2016.
12.
016SimultaneousDeterminationof11ChemicalsAddedinItchingAgentsTraditionalChineseedicinesbyUPLC-MS/MSZHAOJiali,OUBeili,ZHOUYan(JiaxingInstituteforFoodandDrugControl,Jiaxing314050,China)ABSTRACT:OBJECTIVETodevelopamethodforsimultaneousdeterminationof11chemicals(chlorphenaminemaleate,loratadine,miconazolenitrate,hydrochloricacidterbinafine,ketoconazole,estazolam,chlorpromazinehydrochloride,clobetasolpropionate,dexamethasoneacetate,prednisoneacetateandindomethacin)addedillegallyinitchingagentstraditionalChinesemedicines(TCMs)byUPLS-MS/MS.
METHODSSeparationwasperformedonWatersACQUITYUPLCBEHC18column(2.
1mm*100mm,1.
7m),andbygradientelutionwithacetonitrileand5mmol·L1ammoniumacetateaqueoussolution(contain0.
1%formicacid)asthemobilephase.
Thechemicalsdetectedinsampleswereidentifiedbycomparisonofsamplepeakswiththeretentiontime,massspectraandtheproductionswiththoseofreferencesubstances.
RESULTSThedevelopedUPLC-MS/MSmethodwasdidnotinterferedbytheadjuvants.
Thepeaksdetectedcouldbeseparatedfromeachother.
Therangeofdetectionlimits(LODs)for11chemicalswere0.
010.
46ng·mL1.
CONCLUSIONThedevelopedUPLC-MS/MSmethodisconvenient,accurateandsensitive,whichcanbeusedforrapidscreeningofabove-mentionedchemicalsaddedillegallyinTCMs.
KEYWORDS:itchingagentstraditionalChinesemedicine;antihistaminedrugs;antifungalagents;sedativehypnoticdrugs;glucocorticoid;nonsteroidalanti-inflammatorydrugs;UPLC-MS/MS作者简介:赵佳丽,女,主管药师Tel:(0573)83388073E-mail:627113375@qq.
com皮肤瘙痒症是临床上常见的皮肤病之一,多见于老年人.
市场上有发现在止痒类保健食品中非法添加化学物质,并通过一些非法渠道销售,这严重损害了消费者的利益,危害了人民群众的身体健康.
此类保健品多数标示具有清热解毒、祛风止痒等字样,非法添加化学药物随意性大,而添加后止痒效果明显,导致消费者长期依赖并服用而引起毒性反应,甚至危及生命.
目前,非法添加化学药物的报道很多,但未见止痒类制剂中非法添加化学药物的报道.
本实验通过查阅文献[1-14]和大量实验,收集了在止痒类保健品中常添加的抗组胺、抗真菌、镇静安眠、糖皮质激素及非甾体抗炎等5类化学药物,采用UPLC-MS/MS方法,建立了以多离子反应监测(MRM)模式定性定量测定,快速、准确、灵敏地同时检测11种化学药物成分.
该方法可应用于非标检测中的初筛,并可同时进行添加物的定量分析,一次进样可同时准确检测出不同剂型中添加的11种止痒类化学药物,为进一步规范保健食品市场提供强大的技术支撑.
中国现代应用药学2016年12月第33卷第12期ChinJModApplPharm,2016December,Vol.
33No.
12·1559·1仪器与试药1.
1仪器AcquityUPLC型超高效液相色谱(美国Waters公司)、QuattroPremiereXE型三重四极杆串联质谱、电喷雾离子化源(ESI);MassLynx4.
0数据处理系统;10~100μL,100~1000μL,1000~5000μL单道可调移液器(德国Eppendorf公司);Milli-QAcademic纯水系统(美国Millipore公司);BP211D电子天平(德国Sartorius);KQ-500E型超声提取仪(上海仪器有限公司).
1.
2药品与试剂马来酸氯苯那敏、氯雷他定、硝酸咪康唑、盐酸特比萘芬、酮康唑、艾司唑仑、盐酸氯丙嗪、丙酸氯倍他索、醋酸地塞米松、醋酸泼尼松、吲哚美辛对照品均购自中国食品药品检定研究院,纯度均>99%,批号分别为100047-200606、100615-201103、100213-200705、100563-200301、100294-200602、171219-201003、100460-200501、100302-200602、100122-200805、100012-200706、100258-200904.
流动相所用甲醇、乙腈均为色谱纯(德国Merck公司);甲酸(纯度为96%,TEDIA),乙酸铵(色谱纯,TEDIA);实验用水均为Millipore超纯水器制备超纯水.
1.
3样品10批止痒类制剂(清屑解痒胶囊、清屑润痒胶囊、银屑胶囊、复方黄柏去廯搽剂、金脚爽喷剂、喷脚1号、湿疹膏、止痒膏、祛痱止痒膏、SKINS100百灵霜),其中3批为胶囊剂,1批为搽剂,2批为喷雾剂,4批为乳膏剂,均为各县、市区食品药品监督管理局提供的市民投诉、市场监督抽检样品.
2方法2.
1空白基质溶液的配制取胶囊剂、搽剂和喷雾剂阴性样品各3份,分别取内容物混匀,各称取1g,置50mL量瓶中,加甲醇适量,超声处理15min,放冷至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀后,经0.
22μm微孔滤膜滤过,取续滤液适量,用40%甲醇逐步稀释,作为止痒类胶囊剂、搽剂和喷雾剂空白基质提取液.
另取乳膏剂阴性样品各3份,分别取内容物混匀,各称取1g,置50mL量瓶中,先加丙酮10mL溶解,加甲醇适量,同法处理,作为止痒类乳膏剂空白基质提取液.
2.
2混合对照品溶液的制备精确称取马来酸氯苯那敏、氯雷他定、硝酸咪康唑、盐酸特比萘芬、酮康唑、艾司唑仑、、盐酸氯丙嗪、丙酸氯倍他索、醋酸地塞米松、醋酸泼尼松、吲哚美辛对照品各10mg,于10mL棕色量瓶中,用甲醇溶解并定容,制成对照品储备溶液,浓度为1mg·mL1.
分别吸取适量的以上11种对照品储备液于量瓶中,用空白基质提取液稀释并定容,配成浓度为200ng·mL1的混合对照品溶液.
2.
3样品溶液的制备取"1.
3"项下市场抽检的10批止痒类中药制剂进行检测.
取胶囊剂、搽剂和喷雾剂样品的内容物混合均匀,分别称取约1g,置50mL量瓶中,加甲醇适量,超声处理15min,放冷至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀后,经0.
22μm微孔滤膜滤过,取续滤液适量,用40%甲醇逐步稀释.
取乳膏剂样品内容物混合均匀,分别称取约1g,置50mL量瓶中,先加丙酮10mL溶解,加甲醇适量,按"2.
1"项下方法处理.
均供UPLC-MS/MS分析,分别测定10批止痒类中药制剂.
2.
4UPLC条件色谱柱为WatersACQUITYUPLCBEHC18柱(2.
1mm*100mm,1.
7m),A相为乙腈,B相为5mmol·L1乙酸铵(0.
1%甲酸)水溶液,梯度洗脱(0~2min,30%A;2~7min,30%→100%A;7~10min,100%A;10~12min,100%→30%A;12~14min,30%A).
流速为0.
15mL·min1,柱温为40℃,进样量为5μL.
2.
5质谱条件离子源ESI+;毛细管电压:3.
00kV;离子源温度:110℃;RF透镜电压:0V;脱溶剂温度:350℃;脱溶剂气体流量:650L·h1;锥孔反吹气流量:50L·h1;质量分析器:低端分辨率1为13.
0V;高端分辨率1为13.
0V;离子能量1为1.
0eV;低端分辨率2为13.
0V;高端分辨率2为13.
0V;离子能量2为1.
0eV.
检测方式:全扫描一级质谱、选择离子二级全扫描质谱监测方式.
3结果3.
111种化学药物的质谱特性取"2.
2"项下混合对照品溶液(200ng·mL1),按"2.
4"、"2.
5"项下条件进样分析,各化合物准分子离子及对准分子离子进行二级全扫描分析所·1560·ChinJModApplPharm,2016December,Vol.
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12中国现代应用药学2016年12月第33卷第12期得碎片离子、保留时间、锥孔电压及碰撞能量见表1.
经典对照品的二级质谱提取离子流图见图1.
表111种止痒类药物对照品的质谱参数Tab.
1Elevenkindsofitchingdrugsreferencesubstanceofmassspectrumparameters化合物名称母离子(m/z)子离子(m/z)保留时间/min锥孔电压/V碰撞能量/eV马来酸氯苯那敏275.
4230.
2167.
11)3.
083.
082237;18氯雷他定383.
1337.
11)294.
16.
206.
163525;30硝酸咪康唑417.
3161.
01)6.
203028盐酸特比萘芬292.
3140.
81)92.
75.
145.
14820;20酮康唑531.
2489.
21)244.
03.
993.
991030;35艾司唑仑295.
4267.
21)205.
24.
064.
063737;25盐酸氯丙嗪319.
085.
81)4.
513020丙酸氯倍他索467.
4373.
31)355.
26.
446.
482015;10醋酸地塞米松435.
4397.
31)309.
35.
075.
072012;10醋酸泼尼松401.
4383.
3295.
31)4.
624.
622015;10吲哚美辛358.
1173.
8138.
61)6.
136.
092525;12注:1)较稳定的碎片离子.
Note:1)Stablefragmentions.
图1经典对照品的二级质谱提取离子流图A马来酸氯苯那敏;B醋酸泼尼松.
Fig.
1AtypicalreferencesubstanceofextractedionchromatogramsAchlorphenaminemaleat;Bprednisoneacetate.
3.
2专属性试验目前市场上止痒类制剂以口服中药胶囊剂和润肤止痒乳膏剂较多,中药成分比较复杂,乳膏基质成分不明,为考察辅料及基质的干扰,选择空白基质溶液作本底,消除干扰.
并通过比较一级质谱和二级质谱质荷比与上述11种止痒类对照品对照,本法可作为定性鉴定依据,可判断常规辅料及制剂中所含成分不干扰11种止痒类化学药物的检测.
3.
3仪器精密度试验取"2.
2"项下混合对照品溶液连续进样5次,保留时间的RSD均<1%,仪器精密度良好.
3.
4检测限采用对照品溶液,空白基质提取液稀释的方法,以S/N≥3时目标物的含量为该方法的检测限.
经计算本方法测定11种止痒类对照品的检测限如下:马来酸氯苯那敏为0.
04ng·mL1;氯雷他定为0.
08ng·mL1;硝酸咪康唑为0.
10ng·mL1;盐酸特比萘芬为0.
14ng·mL1;酮康唑为0.
20ng·mL1;艾司唑仑为0.
05ng·mL1;盐酸氯丙嗪为0.
01ng·mL1;丙酸氯倍他索为0.
10ng·mL1;醋酸地塞米松为0.
27ng·mL1;醋酸泼尼松为0.
20ng·mL1;吲哚美辛为0.
46ng·mL1.
3.
5样品的定性检查及色谱、质谱行为用本法检验10批次样品,通过分子离子峰,二级碎片、色谱保留时间等信息,可判断样品中被掺入的化学药物有马来酸氯苯那敏、醋酸地塞米松、醋酸泼尼松,丙酸氯倍他索.
样品检验结果见表2.
表2样品检验结果Tab.
2Resultoftest样品名称批号西药成分结果清屑解痒胶囊/马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松+清屑润痒胶囊/马来酸氯苯那敏、醋酸泼尼松+银屑胶囊2H01/复方黄柏去廯搽剂1101501/金脚爽喷剂20120403马来酸氯苯那敏+喷脚1号201204121/湿疹膏/醋酸地塞米松+止痒膏10569/祛痱止痒膏20013/SKINS100百灵霜20160302丙酸氯倍他索+样品的典型图谱见图2,样品中马来酸氯苯那敏和醋酸泼尼松分子离子及碎片质量数、保留时间等与表1和图1中的相应的对照品值一致.
中国现代应用药学2016年12月第33卷第12期ChinJModApplPharm,2016December,Vol.
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12·1561·图2经典样品的二级质谱提取离子流图1马来酸氯苯那敏;2醋酸泼尼松.
Fig.
2Atypicalsampleofextractedionchromate-grams1chlorphenaminemaleat;2prednisoneacetate.
4讨论4.
1色谱条件的优化根据文献[1-14],大多的色谱分离采用由0.
1%甲酸溶液和甲醇或乙腈组成的混合溶液作为流动相.
试验比较了0.
1%甲酸-乙腈体系与0.
1%甲酸-甲醇体系作为流动相时的情况,结果发现0.
1%甲酸-乙腈体系作为流动相时,响应较高.
加入0.
1%甲酸有助于化合物的离子化,可获得较优色谱分离效果和质谱信号响应.
在同样梯度及色谱柱条件下,在流动相水相中加入少量乙酸铵(5mmol·L1),氯雷他定、盐酸氯丙嗪和马来酸氯苯那敏等响应明显增高,峰形得到有效改善.
本法分别对WatersACQUITYUPLCBEH的C18、C82款色谱柱,流动相组成(多个浓度的甲酸和醋酸铵溶液),流速,柱温等多个影响色谱分离效果和质谱响应的因素进行了考察和比较,最终确立上述最优化的梯度洗脱检测条件.
4.
2提取方法的考察本实验中检测的化学止痒药物基本都能溶于甲醇,中药制剂成分复杂,一般采用甲醇提取,对中草药细胞的穿透能力较强,用甲醇提取比用水量较少,提取时间短,提取方式选择超声处理,溶解出的水溶性杂质也少,减少对色谱柱和质谱系统的污染,简单快速.
乳膏剂,先用丙酮溶解提取,再用甲醇定容,所含化学添加物溶解完全,基质干扰小,方便快捷.
4.
3非法添加的确认马来酸氯苯那敏属抗组织胺类药物,用于过敏引起的各种瘙痒,长期使用会导致药物依赖性皮炎;醋酸地塞米松、醋酸泼尼松和丙酸氯倍他索属激素类药物,用于某些危急严重性皮肤病,这类药物用之恰当,力挽沉疴;用之不当,也能引起一系列的生理、病理性变化,严重时还能直接或间接导致死亡.
笔者认为添加者想通过在止痒类中药制剂中添加以上药物,对患者达到"强效、速效"的止痒效果.
而目前,皮肤科治疗手段用的最多的就是使用抗组胺药物和糖皮质激素缓解皮肤瘙痒症.
单纯依靠液相保留时间的方法,仅可粗略判断,而结合质谱对质荷比的筛选,根据分子离子峰,二级碎片、色谱保留时间等信息,不需要实现待测组分与干扰组分的完全分离,以化合物结构特点为基础,采用同一条件下对照品对照法,可确保结果的准确、可靠.
4.
4溶液的稳定性马来酸氯苯那敏在流动相中分别以马来酸及氯苯那敏出峰,选择氯苯那敏为母离子进行二级质谱信息采集,马来酸氯苯那敏对照品溶液放久后色谱峰形变宽,灵敏度差,故对照品应临用新制.
氯雷他定由质谱图[6]可见有分子离子峰及其同位素峰,选择响应较好的383.
1作为母离子,337.
1和294.
1为子离子.
本方法建立了同时测定止痒类中药制剂中违禁添加抗组胺、抗真菌、镇静安眠、糖皮质激素及非甾体抗炎类等五类药物中11种化学药物的检测方法,采用UPLC-MS/MS法快速实现了对11种化学药物的分离分析,各化学药物在MS和MRM色谱图上均得到良好的分离.
前处理提取简单、快速、具有良好的灵敏度和准确性,通过对抽检的10批止痒类样品的检测,验证了本法具有·1562·ChinJModApplPharm,2016December,Vol.
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12中国现代应用药学2016年12月第33卷第12期实际应用价值,适合大批量制剂中违法添加马来酸氯苯那敏等11种止痒类化学药物的快速检测,保障人民群众的用药安全.
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收稿日期:2016-05-06中空纤维离心超滤法测定人血浆中双氯西林的游离浓度巩文艺1,张旭东2(1.
沧州市中心医院药学部,河北沧州061000;2.
河北省人民医院药学部,石家庄050051)摘要:目的采用新型中空纤维离心超滤联合HPLC测定人血浆中双氯西林的游离浓度.
方法采用中空纤维离心超滤法对血浆样品进行预处理.
采用KromasilC18色谱柱进行HPLC测定,流动相为乙腈-25mmol·L1磷酸盐缓冲溶液(pH4.
5)=40∶60,流速1.
0mL·min1,检测波长225nm,柱温20℃.
结果双氯西林在64.
0~4096.
0ng·mL1内线性关系良好(r=0.
9999),定量限为32.
0ng·mL1,回收率为98.
8%~100.
3%,RSD<1.
3%.
结论本方法简便、快速、专属性强、灵敏度高,为双氯西林的游离浓度测定提供了一种新的、可靠的分析手段.