样品WB实验基本步骤说课材料

实验基本步骤

提取细胞蛋白

↓

BCA定量

↓

制备蛋白胶SDS-PAGE胶↓

蛋白样品变性

↓

电泳

↓

转膜

↓

封闭

↓

一抗

↓

TBST洗涤

↓

二抗

↓

TBST洗涤

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↓

显影

↓

结果分析

试剂配制

1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L

磷酸二氢钾 0. 24g

磷酸氢二钠 1.44g

氯化钠 8g

氯化钾 0. 2g

加入500ml纯水调PH=7. 2

定容至1L,高压蒸汽灭菌

2.PBST PBS+0.05%吐温-20

500mlPBS+0. 25ml吐温-20

3.电转液500ml

Tris 1.5g

甘氨酸 7.2g

400ml水溶解

加入100ml甲醇置于4℃冰箱预冷

4.电泳液1X

10x稀释 50ml10x电泳液+450ml纯水

5.TBS

6.TBST TBS+0.05%吐温-20

50mlTBS+450ml纯水+0.25ml吐温-20

7.封闭液

TBST1X+5%奶粉

40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉 40℃预热

WB实验

一、蛋白样品制备

准备:一管细胞 PBS 4℃预冷  PMSF  100mM  移液枪

1000ul 10ul  1. 5mlEP管2个高速冷冻离心机4℃预冷

1.于-20℃冰箱中取出一管细胞样品吸去培养液

2.加入1ml 4℃预冷的PBS 0.01M pH7.27. 3 。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4℃ 8000r离心5min然后弃去上清。重复以上操作一次共洗细胞两次以洗去培养液。

3.按1ml裂解液加10 μ l PMSF 100 mM 摇匀置于冰上。 PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。 

4.在样品中加入300ul含PMSF的裂解液 吹匀于冰上裂解30min为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5.裂解完后于4℃下12000 rpm离心5 min。

7.将离心后的上清分装转移倒0. 5 ml的离心管中放于20℃保存。

二、 蛋白含量的测定BCA定量

准备 96孔板移液枪 1000ul  10ul  200ul   BCA工作液

A+B  50mlEP管 1xPBS BSA标准液

1.将96孔板分好区域若不够分则只做两个重复 外围一圈的孔最好不用

2.算好孔数总的每孔加200ulBCA工作液A+B  A液 B液=50: 1一般配多些如60孔 A液12000ul B液240ul

3.将样品稀释到一定倍数才能定量 10倍 20倍 30倍 每孔需要20ul样品2ul样品+18ulPBS,即稀释10倍 做三个重复则需要60ul一般配80ul

4.配蛋白标准样品将2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至0. 5mg/ml若配200ul的0. 5mg/ml蛋白标准溶液则需要50ul的2mg/ml的蛋白标准溶液和150ul PBS溶液

5.将稀释好的样品加入孔板中 标记的区域 接着标准品按01,2,4,8, 12, 16,20ul加到标号的区域之后在加标准样品的孔内将孔内溶液用PBS补足到20ul

6.每孔加200ul配好的工作液,平行加,不能上下加,以减少误差

7.将加好的96孔板放在37℃下孵育30分钟

8.孵育完后,放在酶标仪轻微震荡3-10s,中速,吸光值595nm,进行比色测定,记录标准曲线及样品吸光值数据后,以蛋白含量ml为横坐标,吸光值为纵坐标作标准曲线。 R2 >0.98才有用,酶标仪操作:两个箭头图标, 1是结果,2是保存

9.计算蛋白含量注意定量样品已经稀释了10倍

蛋白质定量标准曲线加样量

序号 1 2 3 4 5 6 7 8

标准蛋白量

/ul 0 1 2 4 8 12 16 20

0. 5mg/ml

三、 SDSPAGE电泳

1. 配胶12%,可以提前配好

准备玻璃板梳子 AP 解冻现拿现用 聚丙烯酰胺4℃冰箱冷藏

1玻璃板验漏5min

2按表配置分离胶

3灌胶加酒精封压凝30min 注意不要有气泡

4按表配浓缩胶倒掉酒精用吸水纸吸去酒精灌胶插梳子

注意不要有气泡 凝30min

5取胶用水冲洗一下浓缩胶加少量水放入一次性手套中4℃冰箱保存备用

2.样品处理

准备 PBS移液枪 1. 5mlEP管

1稀释样品一般每孔上样5ul 即1mg/ml浓度的样品测完蛋白含量后将样品用PBS稀释至1mg/ml 注意loadingbuffer的加入也得算入

2取出上样样品15ul至1. 5 ml离心管中加入6×SDS上样缓冲液3ul至终浓度为1×。 上样总体积一般不超过15 μ l加样孔的最大限度可加20 μ l样品。 

3将样品在100℃煮5 min震荡使蛋白完全变性注意仪器操作

3. 电泳

准备 电泳液500ml 现配 蛋白胶 10ul移液枪枪头 样品 Marker冰盒 电泳装置

1将SDS-PAGE胶放入电泳槽中加足够的电泳液。 短玻璃板面向内长玻璃板面向外。若只跑一块胶那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。 电泳液至少要漫过内测的短玻璃板。注意先检漏。 

2 上样。用移液枪贴壁吸取样品将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。 加样太快可使样品冲出加样孔若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次 以免交叉污染。 

3先设置80V开始电泳样品溴酚蓝跑至分离胶后增至120V电压 电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳进行转膜。 此时准备好电转液

四、转膜

准备 电转液现配4℃冰箱冷藏  镊子 滤纸 PVDF膜

0.45 um  电转装置冰盒

注意拿滤纸和膜时一定要戴手套或用镊子 因为手上的蛋白会污染膜。

1. 在加有转移液的盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫

2.滤纸浸入电转液中 PVDF膜在甲醇中润湿成半透明小心将膜放入4℃电转液中平衡至少5min。

3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。 一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。 在垫子上垫三层滤纸可三张纸先叠在一起在垫于垫子上 一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

4. 先将玻璃板撬掉才可剥胶撬的时候动作要轻要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动直到撬去玻板。 撬时一定要小心玻板很易裂。 除去小玻璃板后将浓缩胶轻轻刮去浓缩胶影响操作 要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上

做好标记 用手调整使其与滤纸对齐轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上要盖满整个胶膜盖下后不可再移动并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触接触后会发生短路。 转移液含甲醇操作时要戴手套实验室要开门以使空气流通。 