缓冲液wb实验原理

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹技术

SD S聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro等建立主要用于测定蛋白质亚基分子量。We s tern印迹是在SD S聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上将电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至一种固相支持物上应用抗体可与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性反应的特点针对特定蛋白进行鉴别和定量。

原理

1  SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS是一种阴离子去污剂作为变性剂和助溶剂它能断裂分子内和分子间的氢键使分子去折叠破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂例如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后蛋白质分子被解聚使其氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SD S胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。在水溶液中蛋白质-S D S胶束的长度与亚基分子量的大小成正比。因此这种胶束在SD S聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD200KD之间时电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅可以分离蛋白质而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。

2 We stern印迹

在We stern印迹法中待测样品溶解于去污剂和还原剂的溶液中经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后被转移到固相支持物上常用硝酸纤维素滤膜 然后可被染色。随后滤膜可与抗靶蛋白的一抗反应。最后结合上的抗体可用多种二级免疫学试剂与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的A蛋白或抗免疫球蛋白检测。Western印记法可测出1-5ng中等大小的待检蛋白。

方法

1. 样品的制备

从细胞中提取蛋白质样品用于We stern印记的方法有两种一是可以在加样缓冲液中直接溶解完整细胞二是制备细胞提取液。可根据不同的目的采用不同的方法。如果仅是定性实验可应用第一种方法如果需测定蛋白含量并进行定量实验可应用后一种方法。

1.1凝胶加样缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织制备蛋白质样品

1 裂解细胞或组织a. 单层培养细胞用PBS缓冲液漂洗细胞2次弃去洗液并吸尽残余的PBS液体

加入一定体积50200μl的加热到85℃的1×SD S凝胶加样缓冲液[50m m ol/L

Tris.Cl(pH 6.8), 100mmol/L二硫苏糖醇DTT ,2%SDS,0.1%溴酚蓝 10%甘油]溶

解细胞用细胞刮刀把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中用于步骤2 。b. 悬浮培养细胞用冷的PBS充分洗涤细胞后去尽残液加入一定体积用冰预冷

的悬浮缓冲液[0.1mol/L NaCl0.01mol/L Tris.ClpH 7.6 0.001mol/L EDTApH 8.0 

1μg/ml Aprotinin 100μg/ml PMSF] 涡流振荡混匀后加入等体积的2×SDS凝胶加

样缓冲液[100mmol/L Tris.Cl(pH 6.8),200mmol/L二硫苏糖醇DTT ,4%SDS,0.2%

溴酚蓝 20%甘油] 混匀后用于步骤2 。c. 动物组织用冷的PBS洗去残血后加入一定体积用冰预冷的悬浮缓冲液用剪

刀剪碎如有必要可在冰浴下匀浆然后加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液混

匀后用于步骤2 。

2 将样品置于沸水浴中加热10分钟。

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3 室温下以10000r p m将样品离心10分钟将上清移至一新管中分装后冻存于-20℃。

1.2裂解缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织制备蛋白质样品

用于制备哺乳动物细胞蛋白质裂解缓冲液有多种在对靶蛋白的抗原性一无所知的情况下一般使用三去污剂和单去污剂裂解缓冲液然后逐步过渡到更专门的提取方法。

三去污剂裂解缓冲液 50mmol/L Tris.Cl pH 8.0  150mmol/L NaCl 0.02%叠氮钠0.1%SDS 100μg/ml PMSF 1μg/ml Aprotinin 1%NP-40 0.5%去氧胆酸钠

单去污剂裂解缓冲液 50mmol/L Tris.Cl pH 8.0  150mmol/L NaCl 0.02%叠氮钠100μg/ml PMSF 1μg/ml Aprotinin 1%NP-40或Triton X-100。

高盐裂解缓冲液 50mmol/L HEPES pH 7.0  500mmol/L NaCl 100μg/ml PMSF1%NP-40 1μg/ml Aprotinin。

无盐裂解缓冲液 50mmol/L HEPES pH 7.0  100μg/ml PMSF 1%NP-40 1μg/mlAp r o tinin。

1 裂解细胞或组织a. 单层培养细胞用冷PBS缓冲液漂洗细胞2次弃取洗液并吸尽残余的PBS液体

加入一定体积50200μl用冰预冷的裂解缓冲液置于冰上孵育20分钟。然后用

细胞刮刀将细胞刮下连同裂解缓冲液一起移至微量离心管中用于步骤2 。b. 悬浮培养细胞用冷的PBS充分洗涤细胞后去尽残液加入一定体积用冰预冷的

裂解缓冲液重悬细胞于冰上放置30分钟后用于步骤2 。d. 动物组织用冷的PBS洗去残血后加入一定体积用冰预冷的裂解缓冲液用剪

刀剪碎如有必要可在冰浴下匀浆用于步骤2 。

2于4℃以12000rpm将裂解物离心2分钟。

3将上清移至一新管中分装后冻存于-20℃。电泳时取出适量的提取液50μg与等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液混合后置于沸水浴中加热5分钟以使蛋白变性。

2蛋白含量的测定Bradford

2.1所需试剂

1 0.15mol/LNaCl NaCl 0.88g

水 100ml

2 0.5mg/ml牛血清白蛋白 BSA  BSA 0.5mg

0.15mol/LNaCl 1ml

3 考马斯亮蓝溶液

在1L容量瓶中将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇加入100ml磷

酸然后补加水至容量瓶体积。用滤纸过滤后于4℃保存。

2.2操作步骤

1 分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/mlBSA 1.0 2.5 5.0 10和20μl 以

0.15mol/L NaCl补足体积至20μl 同时以两管20μl的0.15mol/L NaCl作空白对照。

2 每管各加入480μl考马斯亮蓝溶液振荡混匀室温放置2分钟。

3 用1 cm光径的比色杯测A595取A595吸光值对标准蛋白浓度作图画出标准曲线。

4 取待测样品2.5μl补加0.15mol/L NaCl 17.5μl 480μl考马斯亮蓝溶液混匀后

在A595下比色从B S A标准曲线中确定待测样品的蛋白含量。如果待测样品的浓度

过高可稀释后再测。

3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和We stern印迹

3.1所需试剂

1 30%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 29g

NN′ -亚甲双丙烯酰胺 1g

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水 100ml

2 10%SDS SDS 10g

水 100ml

3 1.5mol/LTris pH8.8  Tris 18.17g

水 80ml

溶解后用浓H Cl调pH至8.8补水至100ml 4℃保存。

4 10%过硫酸铵

过硫酸铵 0.1g

水 1ml

4℃保存可使用一周。

5 1.0mol/LTris pH6.8  Tris 12.11g

水 80ml

溶解后用浓HCl调pH至6.8补水至100ml 4℃保存。

6 Tris-甘氨酸电泳缓冲液25mmol/L Tris 250mmol/L甘氨酸 0.1%SDS Tris 3.02g

甘氨酸 18.8g

10%SDS 10ml

水至 1000ml

7 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳12%分离胶所需溶液水 3.3ml

30%丙烯酰胺溶液 4.0ml

1.5mol/L Tris pH 8.8 2.5ml

10%SDS 0.1ml

10%过硫酸铵 0.1 ml

TEMED 0.004ml

8 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所需溶液水 3.4ml

30%丙烯酰胺溶液 0.83ml

1.0 mol/L Tris pH 6.8 0.63ml

10%SDS 0.05ml

10%过硫酸铵 0.05ml

TEMED 0.005ml

9 甲醇冰醋酸固定液 甲醇 450ml

冰醋酸 450ml

水 100ml

10 0.25%考马斯亮蓝R250染液考马斯亮蓝R250 0.25 g

甲醇冰醋酸固定液 100ml

11转移缓冲液48 mmol/L Tris 39mmol/L甘氨酸 0.037%SDS 20%甲醇 Tris 5.8g

甘氨酸 2.9g

10%SDS 3.7ml

甲醇 200ml

水至 1000ml

12丽春红储存液 丽春红S 2g

三氯乙酸 30g

磺基水杨酸 30g

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水至 100ml 使用时用水稀释10倍。

13封闭液[10mmol/L Tris.Cl pH 7.5  150mmol/L NaCl 2%Tween 20 4%BSA] 

1mol/L Tris.Cl pH 7.5 1ml

1mol/LNaCl 15ml

20%Tween 20 10ml

牛血清白蛋白 BSA 4g

水至 100ml

14洗涤缓冲液[10mmol/L Tris.Cl pH 7.5  150mmol/L NaCl 0.05%Tween 20] 

1mol/L Tris.Cl pH 7.5 1ml

1mol/LNaCl 15ml

20%Tween 20 0.25ml

水至 100ml

15抗体稀释液 BSA 0.4g 洗涤缓冲液 100ml

分装后 -20℃冻存。

16 ECL检测试剂盒北京普利莱公司产品。

3.2操作步骤

3.2.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

1 根据厂家说明书安装好垂直板电泳槽的玻璃板。

2 配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳12%分离胶溶液。

3 迅速在两玻璃板的间隙中灌注分离胶溶液留出灌注积层胶所需空间梳子的齿长再加1厘米 。用吸管小心地在分离胶溶液上覆盖一层水以防止空气中的氧进入凝胶而抑制聚合反应。将凝胶垂直放置于室温下聚合。

4 分离胶聚合完全后倾去覆盖层液体用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙稀酰胺。尽可能排去凝胶上的液体再用纸巾的边缘吸净残留液体。5 制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶溶液。

6 在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶立即在积层胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡再补充一些积层胶溶液以充满梳子之间的空隙将凝胶垂直放置于室温下聚合。

7 当积层胶发生聚合时从-20℃取出已制备好的样品及标准蛋白在100℃下加热5分钟以使蛋白变性。

8 积层胶聚合完全后小心移去梳子用水冲洗齿孔以去除未聚合的丙稀酰胺。将凝胶固定于电泳装置上上、下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。

9 按预定顺序加样并在所有不用的样品孔中加入1×SDS凝胶加样缓冲液。

10将电泳装置与电源相接凝胶上所加电压为8V/cm。当溴酚蓝前沿进入分离胶后把电压提高到15V/cm继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部然后关闭电源。

11从电泳装置上卸下玻璃板用刮勺撬开玻璃板取下凝胶进行考马斯亮蓝染色或We stern印迹。

3.2.2 用考马斯亮蓝对SDS聚丙稀酰胺凝胶染色

1 用至少5倍体积的考马斯亮蓝染液浸泡凝胶放在平缓摇动的平台上于室温

染色4小时以上。

2 移出凝胶并回收染液以备后用将凝胶浸泡于甲醇-冰醋酸固定液中脱色至

蛋白带非常清晰为止中间需更换几次脱色液。

3 移出凝胶至含20%甘油的水溶液中 4℃保存。可随时进行凝胶图象分析或照

相。

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3.2.3 Western印迹

1 当SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳即将结束时切6张滤纸和1张硝酸纤维素膜其

大小应与凝胶的大小完全吻合。如果滤纸或凝胶的面积大于凝胶滤纸和滤膜伸

出的边缘就大有机会相接触造成电流短路而使蛋白质不能从凝胶向滤膜转移。

2 把硝酸纤维素滤膜漂浮于一盘蒸馏水中借毛细作用使之从下往上湿润后将

之浸没于水中。

3 在一浅盘中加入一定量的转移缓冲液将6张滤纸浸泡于其中。

4 带手套安装转移装置先平放底部电极阳极 上放海绵夹层然后依次放

上3张浸湿的滤纸、硝酸纤维素滤膜、凝胶及另外剩余的3张浸湿的滤纸和海绵

夹层最后用玻璃棒赶出所有的气泡放上上方电极阴极 插入电转移槽中。

5 连接电源根据凝胶面积按0.65mA/cm2接通电流 电转移1.52.0小时。

6 断开电源取出滤膜直接浸入蒸馏水中稍漂洗一下后移至丽春红染液中

染色510分钟再用蒸馏水漂洗几次蛋白带清晰可见迅速标出标准蛋白所

在位置后进行下面的免疫检测。

7 加封闭液封闭滤膜室温1小时或4℃过夜然后用洗涤缓冲液室温下洗三次每次10分钟也可以不洗直接从封闭液中取出滤膜去尽残液加入含0.4%BSA的洗涤缓冲液稀释的一抗先取一张保鲜膜固定在桌面上蛋白面朝上放上滤膜滴加适量的抗体以覆盖整张膜 室温孵育1小时后用洗涤缓冲液室温下洗膜三次每次10分钟去尽残液后用同样方法加HRP标记的二抗于膜上室温孵育1小时后用洗涤缓冲液室温下洗膜三次每次10分钟去尽残液后将膜放置于一新的保鲜膜上同时将ECL检测试剂盒中的两种试剂等体积混合0.125ml/cm2膜 室温下反应1分钟后加至滤膜上将膜在室温孵育1分钟然后将膜上的液体去净把膜用保鲜膜包好放入压片盒中在暗室中将X光片放于膜上曝光30秒10分钟或更长最后进行显影、定影。

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